趙曉燕，劉鐘杰，李彩虹，李 琴，邢曉旭，田 丹，韓 博

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀100193）

骨碎補(bǔ)味苦、性溫，入肝、腎經(jīng)。始載于《本草拾遺》，主治腎虛腰痛，骨傷，風(fēng)濕痹痛。是補(bǔ)腎中藥中的佼佼者，與其他中藥同等條件下作用于成骨細(xì)胞株，作用最為突出［1］。骨碎補(bǔ)多項(xiàng)臨床及動(dòng)物試驗(yàn)表明，其檢驗(yàn)指標(biāo)與骨保護(hù)素（OPG）互為聯(lián)系［2］。本試驗(yàn)以大鼠成骨細(xì)胞為模型，假定骨碎補(bǔ)水提液能調(diào)節(jié)OPG mRNA的表達(dá)，且作用與雌激素受體通路相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 藥液制備 骨碎補(bǔ)飲片，購(gòu)自北京同仁堂，將其和蒸餾水按1∶10（W∶V）的比例混合，文火加熱沸騰25min，濾出藥液后再加8倍蒸餾水煮沸25 min，合并兩次濾液離心取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成濃度為2g／mL的生藥液，調(diào)pH 值至7.2～7.4。臨用前用DMEM完全培養(yǎng)液配制成不同濃度的骨碎補(bǔ)培養(yǎng)液，以不加藥物的DMEM完全培養(yǎng)液作為對(duì)照組。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定 新生24h內(nèi)SD大鼠，購(gòu)自北京興隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)，參照吳培福方法，體外培養(yǎng)大鼠顱骨成骨細(xì)胞［3］。并通過(guò)形態(tài)學(xué)觀(guān)察、瑞氏染色和鈣化結(jié)節(jié)染色的方法對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，鑒定成骨細(xì)胞培養(yǎng)成功。

采用第3代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。細(xì)胞同步化后，試驗(yàn)組換為含不同濃度骨碎補(bǔ)水提液、陽(yáng)性對(duì)照組換為含雌二醇完全培養(yǎng)液；陰性對(duì)照組換為完全培養(yǎng)液，或者試驗(yàn)組換含10mg／mL骨碎補(bǔ)水提液＋10－7mol／L ICI 182 780的完全培養(yǎng)液，作用48h后提取總mRNA。

1.3 細(xì)胞總 mRNA的提取 按照說(shuō)明書(shū)，用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。

1.4 RT－PCR 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA為模板進(jìn)行基因擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1，產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析。

表1 大鼠成骨細(xì)胞中β－actin、OPG引物序列

1.5 目的基因的克隆制備 按照說(shuō)明書(shū)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、回收?；厥债a(chǎn)物與pEASY－T3載體連接后，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆，37℃ 搖床過(guò)夜培養(yǎng)后菌液送檢測(cè)序，用質(zhì)粒提取試劑盒提取陽(yáng)性菌液質(zhì)粒。

1.6 β－actin、OPG標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)構(gòu)建和不同組成骨細(xì)胞中基因水平的檢測(cè) 構(gòu)建這2個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以不同處理的成骨細(xì)胞cDNA作為模板，用熒光定量PCR對(duì)基因進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得出OPG的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05顯著性差異，P＜0.01極顯著性差異。所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

不同濃度骨碎補(bǔ)水提液作用于成骨細(xì)胞48h后，10mg／mL組、1mg／mL組、0.1mg／mL組顯著促進(jìn)OPG基因水平的表達(dá)，其中10mg／mL組作用與雌二醇組差異不顯著；0.01mg／mL、0.001 mg／mL促進(jìn)作用不顯著，見(jiàn)圖1。

10mg／mL骨碎補(bǔ)水提液與雌激素受體抑制劑一同作用于成骨細(xì)胞后，促進(jìn)OPG基因水平表達(dá)的作用受到抑制，見(jiàn)圖2。

3 討論

骨骼是代謝活躍的器官，在整個(gè)生命過(guò)程中都在進(jìn)行著吸收與重建。這個(gè)過(guò)程受成骨細(xì)胞的調(diào)控：成骨細(xì)胞表達(dá)NF－κB受體活化因子配體（RANKL）與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面上的NF－κB受體活化因子（RANK）結(jié)合，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化及骨吸收；同時(shí)成骨細(xì)胞還分泌OPG，與RANKL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，從而抑制RANKL和RANK之間的作用，以防止骨吸收過(guò)度。因此OPG、RANKL任何一方的改變都能影響骨吸收或重建的進(jìn)程。

廖悅?cè)A等通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)證明，骨碎補(bǔ)能抑制激素缺乏引起的骨流失，對(duì)糖皮質(zhì)激素引起的骨質(zhì)疏松也有一定作用［4－6］。大量細(xì)胞試驗(yàn)證明，骨碎補(bǔ)提取物及其主要成分對(duì)成骨細(xì)胞或骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖、分化及鈣化均有促進(jìn)作用［7－9］。有試驗(yàn)證明，骨碎補(bǔ)提取物抑制破骨細(xì)胞性骨吸收［10］。種種跡象表明，骨碎補(bǔ)是治療骨質(zhì)疏松的有效藥物。有試驗(yàn)證明，以骨碎補(bǔ)主要成分的骨靈片能顯著提高去勢(shì)小鼠血清中OPG／RANKL比值［11］。本試驗(yàn)中，一定濃度的骨碎補(bǔ)作用于成骨細(xì)胞，高劑量組顯著促進(jìn)OPG基因水平的表達(dá)，低劑量組促進(jìn)作用不顯著。證明骨碎補(bǔ)水提液能增高大鼠成骨細(xì)胞內(nèi)基因水平OPG的表達(dá)，且呈劑量依賴(lài)關(guān)系。推測(cè)，骨碎補(bǔ)主要通過(guò)作用于OPG影響OPG／RANKL／RANK系統(tǒng)，進(jìn)而影響破骨細(xì)胞的增殖分化。

本試驗(yàn)中，雌激素受體抑制劑與骨碎補(bǔ)共同作用于成骨細(xì)胞后，骨碎補(bǔ)促進(jìn)OPG表達(dá)作用受到抑制，與骨碎補(bǔ)單獨(dú)培養(yǎng)差異顯著。因此，雌激素受體通路至少是骨碎補(bǔ)促進(jìn)OPG基因表達(dá)，增高OPG／RANKL比值的通路之一。周繼凱試驗(yàn)證明，骨碎補(bǔ)促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞增殖、分化是通過(guò)雌激素受體通路［12］。骨碎補(bǔ)通過(guò)雌激素通路對(duì)成骨細(xì)胞起作用，由此可以推測(cè)其為潛在的植物性雌激素。對(duì)骨碎補(bǔ)詳細(xì)的機(jī)制研究有助于其在臨床上的應(yīng)用。

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［12］周繼凱，李煥德.2－骨碎補(bǔ)促成骨細(xì)胞分化作用的機(jī)制研究：湖南省藥學(xué)會(huì)第12次會(huì)員代表大會(huì)暨2008年學(xué)術(shù)年會(huì)［C］.長(zhǎng)沙：2008.