江青東，王慧杰

（鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校繼續(xù)教育學(xué)院，河南 鄭州450011）

5－羥色胺（5－HT）是一種吲哚衍生物，分子式C10H12N2O。5－HT在腦組織中的濃度較高，它是調(diào)節(jié)神經(jīng)活動(dòng)的一種重要物質(zhì)［1－4］。同時(shí)美國(guó)辛辛那提大學(xué)醫(yī)學(xué)院的納爾遜·霍斯曼和其他研究人員發(fā)現(xiàn)，5－羥色胺會(huì)發(fā)出一種信號(hào)，降低奶牛的產(chǎn)奶量。只要抑制奶牛乳腺中的5－HT含量，就可以將產(chǎn)奶量提高15%。其機(jī)理是乳腺上皮合成的5－HT抑制了催乳素（PRL），對(duì)乳腺的刺激，影響乳腺的發(fā)育和泌乳，抑制PRL刺激的乳蛋白基因表達(dá)，提示是經(jīng)過 5－HT 受 體 產(chǎn) 生 的［5－7］。 目 前，哺 乳 動(dòng) 物 5－HTR基因在乳腺組織中的分布尚未有報(bào)道，本試驗(yàn)通過RT－PCR技術(shù)克隆了奶山羊乳腺組織中5－HTR1基因，為進(jìn)一步研究5－HT在其受體的作用下對(duì)哺乳動(dòng)物牛的乳腺發(fā)育和調(diào)控泌乳方面提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集 取泌乳期奶山羊（購(gòu)自陜西薩能奶山羊養(yǎng)殖基地）乳腺組織，入液氮速凍，置－80℃保存，待測(cè)。

1.2 酶與試 劑 AMV 反轉(zhuǎn) 錄 酶、RNase－Inhibitor、Oligo（dT）、Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、Buffer、DNA Marker、pMD－19T 載 體、TaKaRa Agarose Gel、DNA Purification Kit Ver.2.0、E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞、T4DNA連接酶等，均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；動(dòng)物組織RNAout（Sigma）。

1.3 PCR引物的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank公布的牛和鼠的5－HTR1基因的同源序列，利用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件和BLAST鑒定設(shè)計(jì)1對(duì)克 隆 引 物。 上 游：5′－TGGTGATGCCCTTCAGCATTGTGTATA TTGT－3′，下游：5′－GGAAGCCAACATATTACAAATGCACCCAAG－3′，預(yù)期片段680bp，引物由北京三博遠(yuǎn)志生物科學(xué)技術(shù)有限公司合成。

1.4 奶山羊乳腺組織總RNA的提取及含量測(cè)定按照動(dòng)物組織RNAout試劑盒的說明書進(jìn)行提取乳腺組織總RNA：0.8%瓊脂糖凝膠電泳（130V，

15min），紫外燈下觀察，檢查其完整性。核酸分析儀測(cè)定OD260和OD280，檢測(cè)RNA的純度及含量。

圖1 乳腺組織中總RNA電泳結(jié)果

1.5 RT－PCR法 cDNA合成體系 模板RNA 2 μL，5×Buffer 4μL，dNTP Mix（2.5mmol／L）4 μL，RNase Inhibitor（40U／μL）0.5μL，Oligo（dT）18（50pmol／L）1μL，AMV（5U／μL）0.5μL，DEPC－H2O 6μL，總體積20μL。混勻，室溫放置10min，入42℃1h，置－20℃冰箱備用。PCR擴(kuò)增體系：10×Buffer（Mg2＋）5μL，dNTP Mix（2.5 mmol／L）6μL，25mmol／L MgCl26μL，r Taq （5 U／μL）0.5μL，上、下游引物（20pmol／L）各1μL，cDNA 4μL，ddH2O 14μL，總體積50μL。PCR反應(yīng)程序 ：95℃變性5min；95℃10s，52℃20s，72℃30s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應(yīng)完成，分別取5μL PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠、100 V、30min電泳。凝膠成像系統(tǒng)照像并檢測(cè)PCR產(chǎn)物積分光密度（IOD）值，用各基因與β－actin的比值相對(duì)定量轉(zhuǎn)錄水平。

1.5.1 PCR產(chǎn)物回收 目的片段的回收參照上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司UNIQ－10膠回收試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.2 目的基因的克隆與測(cè)序 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，與pMD－19T載體連接，構(gòu)建克隆載體。轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，重組質(zhì)粒通過酶切和PCR鑒定：1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果；陽(yáng)性菌液送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.6 序列分析 利用BioXM 2.6、DNAStar軟件及Blast、Smart進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 RT－PCR擴(kuò)增及克隆 RT－PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到了長(zhǎng)度為680bp的目的片段（圖2）。菌落PCR鑒定得到同樣大小的目的片段（圖3）。

2.2 奶山羊5－HTR1基因的克隆序列 測(cè)序結(jié)果及推測(cè)的氨基酸序列如圖4?？寺〉哪躺窖?－HTR1基因包含一個(gè)完整的開放閱讀框架（open reading frame，ORF），長(zhǎng)為680bp，分子量為110.29 kDa，其中酸性氨基酸為45個(gè)，堿性氨基酸為56個(gè)，等電點(diǎn)為4.77。

2.3 奶山羊5－HTR1基因的種屬差異分析

DNAStar分析發(fā)現(xiàn)，奶山羊5－HTR1基因的ORF與人 （NM－000866）、鼠 （NM－021857）和 牛 （NM－001206605）同源性分別為73.3%、82.1%、93.2%。Blast序列比較分析，奶山羊5－HTR1氨基酸序列與牛和鼠的同源性分別為91%和81%，相似性分別為87%和81%；Smart分析發(fā)現(xiàn)，奶山羊5－HTR1基因推測(cè)氨基酸序列信號(hào)肽與牛、鼠5－HTR1氨基酸序列信號(hào)肽均為1～45aa，SapB結(jié)構(gòu)域均為78～145aa，結(jié)構(gòu)特征與牛、鼠的5－HTR1結(jié)構(gòu)特征相一致。

3 討論

5－HT分布全身，尤其在血小板和腸內(nèi)更多，腦內(nèi)主要是在中縫核及延腦中。迄今為止已發(fā)現(xiàn)人類5－HT受體至少有7大類，這7種類型又可進(jìn)一步分成若干亞型［8－11］。按照受體轉(zhuǎn)導(dǎo)方式的不同，可分為G蛋白偶聯(lián)體超家族和配體門控離子通道族兩大類。5－HTR1主要分布于基底節(jié)及新皮層區(qū)，周圍組織血管及神經(jīng)節(jié)中也有分布［12］。目前5－HTR激動(dòng)劑和抑制劑都是用于神經(jīng)系統(tǒng)的藥物，治療精神疾?。?3］。況且沒有專門針對(duì)5－HTR的藥物，將這些化學(xué)藥物用于奶牛，一是會(huì)影響奶牛的健康，最重要的是這些化合物會(huì)在奶里殘留，進(jìn)而影響人的健康。本試驗(yàn)通過牛和鼠在其他組織中的5－HTR1基因序列設(shè)計(jì)同源性引物采用RT－PCR方法克隆出奶山羊乳腺組織中5－HTR1的基因組全序列，將對(duì)下一步針對(duì)乳腺中的5－HTR，通過基因敲除技術(shù)，提高哺乳動(dòng)物的產(chǎn)奶量提供理論基礎(chǔ)。

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