張文謹(jǐn)，彭 瑤，連增林，靳 冉，李晉生，海麗娜

子宮內(nèi)膜癌是婦科常見的惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于子宮頸癌。大部分子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與雌激素有關(guān)，分化好的腺癌雌激素受體陽性率高[1]。子宮內(nèi)膜癌的治療方法眾多，中藥具有一定的抗腫瘤作用。復(fù)方苦參注射液是目前臨床應(yīng)用比較廣泛的腫瘤輔助治療藥物之一，對(duì)放化療均有一定的增效減毒作用，但是缺乏其作用機(jī)制的深入研究。

本研究采用復(fù)方苦參注射液及其組方成分作用子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細(xì)胞，觀察用藥各組對(duì)HEC-1B細(xì)胞增殖作用的影響，初步探討復(fù)方苦參注射液抗腫瘤作用機(jī)制，研究不同藥物對(duì)Bcl-2/Bax、P27表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫），順鉑（北京中日友好醫(yī)院），復(fù)方苦參注射液、單苦參注射液、單白土苓注射液（均由山西振東制藥有限公司提供），DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），胎牛血清（FBS）（美國(guó)Gibco公司），Reverse Transcription System（美國(guó)Promega公司），Trizol Reagent（美國(guó)invitrogen公司），GoldView TM核酸染料、100 bp DNA Ladder，PCR反應(yīng)體系（購(gòu)于北京賽百盛基因技術(shù)有限公司）。

Mastercycler pros梯度PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司），Molecular Imager Gel Doc（美國(guó) Bio-Rad Laboratories公司），Inc、HERA cell 150恒溫二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱（美國(guó) Thermo Electron Corporation公司），Olympus倒置顯微鏡（日本Olympus Corporation公司）。

所用引物序列以專業(yè)引物設(shè)計(jì)軟件Premier 5.0設(shè)計(jì)而成。ERα36、ERα66、GAPDH 引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HEC-1B細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，放置于37℃、5%CO2飽和濕度的孵育箱中孵育，2.5%胰酶常規(guī)消化傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HEC-1B細(xì)胞，以0.25%胰酶消化后用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）制成單細(xì)胞懸液，以1×105個(gè)/mL細(xì)胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，100 μL/孔。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%~80%融合時(shí)，換成無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步于靜止期后分組[2]。一共分為5組：細(xì)胞對(duì)照組、陽性對(duì)照組（DDP）、復(fù)方苦參注射液組（FK）、苦參注射液組（K）、白土苓注射液組（B）。順鉑注射用粉針劑用生理鹽水稀釋后加DMEM培養(yǎng)基，設(shè)高中低3個(gè)劑量組，終濃度分別為5、2.5、1.25 μg/mL。復(fù)方苦參注射液加DMEM培養(yǎng)基稀釋，終濃度為10%、5%、2.5%。各組藥物濃度配比設(shè)計(jì)見表1。各用藥組每個(gè)濃度均設(shè)5個(gè)平行孔，用藥處理 24、48、72 h 后，加入四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去每孔的液體，加入二甲基亞砜（DMSO）100 μL/孔，微振蕩器上震蕩 15 min，用雙波長(zhǎng)法（492 nm/630 nm）測(cè)出細(xì)胞對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組的吸光度值[3]。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，按公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（IR）：IR＝（1－實(shí)驗(yàn)組 OD/對(duì)照組 OD）×100%。

表1 各給藥組藥物終濃度配比表

1.2.3 RT-PCR法檢測(cè)Bcl-2/Bax、P27表達(dá)水平取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，先用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞處于靜止期同步化后，分為5組：復(fù)方苦參注射液組（FK）、苦參注射液組（K）、白土苓注射液組（B）、順鉑注射液組（DDP）、空白對(duì)照組。藥物配制方法同上，各組藥物濃度設(shè)計(jì)見表2。加入各組藥物繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

表2 各給藥組藥物終濃度配比表

按Trizol法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法測(cè)定提取的總RNA含量及純度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參照，進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物序列見表3。反應(yīng)程序：Bcl-2（94℃變性5 min，94℃30秒，58℃ 30秒，72℃ 1 min，72℃延伸 5 min，共35個(gè)循環(huán)）；Bax（94℃變性 150 s，94℃ 40秒，63℃40秒，72℃40 s，72℃延伸7 min，共30個(gè)循環(huán)）；P27（94℃變性 5 min，94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃1 min，72℃延伸5 min，共 35個(gè)循環(huán)）；GAPDH（95℃變性 5 min，94℃1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，72℃延伸7 min，共30個(gè)循環(huán)）。

反應(yīng)結(jié)束后以含有GoldView TM核酸染料的1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。在紫外光凝膠成像分析系統(tǒng)下攝片，以Bcl-2/Bax、P27基因片段與GAPDH片段灰度值的比值作為其相應(yīng)表達(dá)水平數(shù)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表3 引物序列及其PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 結(jié)果表明，各組藥物作用48 h后顯示出對(duì)細(xì)胞的抑制作用，復(fù)方苦參注射液和苦參注射液低濃度對(duì)人子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細(xì)胞不但沒有明顯的抑制增殖作用反而出現(xiàn)輕微的促增殖作用，但隨用藥濃度的增加表現(xiàn)出抑制作用，并且該作用隨著藥物劑量的增加而逐漸增強(qiáng)，其作用呈濃度依賴趨勢(shì)。白土苓注射液幾乎不影響細(xì)胞生長(zhǎng)，吸光度值與空白對(duì)照組比較，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。不同給藥組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），復(fù)方苦參注射液組對(duì)細(xì)胞抑制作用最強(qiáng)。各組細(xì)胞抑制率見圖1。

圖1 不同給藥組對(duì)HEC-1B細(xì)胞抑制率

2.2 RT-PCR檢測(cè)Bcl-2/Bax、P27的表達(dá) 從電泳圖觀察，F(xiàn)K、K、DDP組Bcl-2的表達(dá)較空白對(duì)照組明顯減弱（P<0.05），而Bax、P27的表達(dá)量明顯增強(qiáng)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖2、圖3。

圖2 不同給藥組對(duì)Bcl-2/Bax、P27 mRNA水平的影響

3 討論

復(fù)方苦參注射液（巖舒）是以苦參、白土苓為主的兩味中草藥經(jīng)現(xiàn)代技術(shù)加工制成，其功效為清熱利濕、涼血解毒、散結(jié)止痛。臨床多用于晚期癌癥的輔助治療，具有較好的輔助抗癌及緩解患者癌性疼痛的作用。近年來，大量臨床研究證實(shí)，復(fù)方苦參注射液在放化療中不僅能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，而且具有增效減毒作用[4]。本研究證實(shí)了復(fù)方苦參注射液和苦參注射液能夠抑制人子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細(xì)胞生長(zhǎng)，且該作用呈劑量依賴關(guān)系。

Bcl-2基因家族是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)者，其成員通過調(diào)節(jié)線粒體外膜的通透性和完整性起重要調(diào)控作用。正常子宮內(nèi)Bcl-2與Bax表達(dá)具有一定周期性，Bcl-2表達(dá)增殖期高于分泌期、Bax表達(dá)分泌期高于增殖期[5-7]，說明雌孕激素可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡與增殖來維持子宮內(nèi)膜的正常生理功能。本研究結(jié)果顯示，復(fù)方苦參注射液、苦參注射液均能有效抑制HEC-1B細(xì)胞Bcl-2基因mRNA水平的表達(dá)，但苦參并未見增加HEC-1B細(xì)胞Bax基因表達(dá)的作用，而復(fù)方苦參注射液在抑制Bcl-2表達(dá)的同時(shí)還可增加Bax基因表達(dá)，證明復(fù)方苦參注射液的抗腫瘤作用機(jī)制在于對(duì)Bcl-2/Bax表達(dá)的調(diào)控，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

圖3 不同給藥組Bcl-2、Bax、P27相對(duì)表達(dá)量

P27基因是一種調(diào)控細(xì)胞周期并抑制細(xì)胞分裂的重要基因，定位于第12號(hào)染色體短臂1區(qū)3帶（12p13），其編碼的蛋白P27kip1是一種非特異性多功能周期素依賴性激酶抑制劑（CDKI），通過抑制cyclin-CDK復(fù)合物的生物活性來調(diào)控細(xì)胞周期，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞在G1/S期停滯[8]。研究發(fā)現(xiàn)P27在子宮內(nèi)膜增殖過程中起到調(diào)控作用，其表達(dá)缺失是發(fā)展為子宮內(nèi)膜癌的重要一步。本研究結(jié)果顯示復(fù)方苦參注射液和苦參注射液均有增加子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細(xì)胞P27基因mRNA水平表達(dá)，證明復(fù)方苦參注射液對(duì)HEC-1B細(xì)胞抑制作用還依賴于對(duì)細(xì)胞周期的影響[9]。

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