馬濤 肖品 聶磊

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，青海西寧810001)

藏藥“葉蒙”，為毛茛科鐵線蓮屬植物，其花白色的在青藏高原上只有短尾鐵線蓮Clematis brevicaudata DC.比較符合藏文獻(xiàn)的描述〔1〕，《宇妥本草》中“斂黃水”的功效與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的抗炎、鎮(zhèn)痛相一致。本著開(kāi)發(fā)藏藥的目的，本文用抗炎鎮(zhèn)痛的藥效學(xué)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究同時(shí)確定其有效部位，收到滿意的效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 薄層色譜

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 供試品溶液的制備:對(duì)照藥材與實(shí)驗(yàn)用藥材分別粉碎(過(guò)80目篩)、用石油醚脫脂，濾渣用95%乙醇加熱回流3次，合并后趁熱過(guò)濾，濾液減壓回收乙醇，濾渣用少量乙醇溶解，作為薄層色譜分析的點(diǎn)樣溶液。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備:取齊墩果酸的對(duì)照品加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

1.2.3 對(duì)照藥材品溶液的制備:取短尾鐵線蓮的對(duì)照藥材加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對(duì)照藥材溶液。

1.2.4 薄層層析條件選擇:硅膠G板(青島海洋化工分廠，規(guī)格50×100);展開(kāi)劑:三氯甲烷－甲醇－水(13:7:2)的上層溶液，三氯甲烷－丙酮－乙酸(12:3:0.7)的上層溶液;顯色劑:10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰〔2〕。

1.2.5 操作:硅膠G板:從左到右點(diǎn)樣，用相應(yīng)的展開(kāi)劑分別展開(kāi)，顯色劑顯色。

注:左圖中，從左往右點(diǎn)樣依次是齊墩果酸對(duì)照溶液、齊墩果酸粗提物溶液、短尾鐵線蓮的對(duì)照藥材溶液、實(shí)驗(yàn)用藥材溶液;右圖中，從左往右點(diǎn)樣依次是齊墩果酸對(duì)照溶液、齊墩果酸粗提物溶液。黑色斑點(diǎn)表示齊墩果酸。

1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用三氯甲烷－甲醇－水(13:7:2)展開(kāi)劑展開(kāi)的齊墩果酸對(duì)照品、藥材對(duì)照品、供試品和齊墩果酸粗提品，斑點(diǎn)清晰，無(wú)拖尾現(xiàn)象，在紫外燈(365nm)下，對(duì)照藥材斑點(diǎn)、供試品斑點(diǎn)、粗提品斑點(diǎn)在與對(duì)照品斑點(diǎn)相同的位置上，并顯出紫藍(lán)色，其Rf均為0.54。初步鑒定結(jié)果是:短尾鐵線蓮中含有齊墩果酸。

②嚴(yán)格執(zhí)行醫(yī)院相關(guān)規(guī)定,且定期對(duì)護(hù)理人員進(jìn)行培訓(xùn),繼而讓其完全掌握無(wú)菌操作理念,且進(jìn)一步增強(qiáng)技能水平,養(yǎng)成嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度、高度的責(zé)任心,繼而起到避免醫(yī)院感染事件的發(fā)生。

2 抗炎實(shí)驗(yàn)

2.1 儀器、試劑與動(dòng)物

2.1.1 儀器:RE－52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (上海亞榮生化儀器廠);SHZ－III型循環(huán)水真空泵 (上海亞榮生化儀器廠);DL－360E智能超聲波清洗器 (上海之信儀器有限公司);HH－4數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司);TD電子天平(余姚市金諾天平儀器有限公司);一次性無(wú)菌注射器(1mL)(江西金山醫(yī)療器械有限責(zé)任公司);一次性無(wú)菌注射器(10mL)(陜西省華秦醫(yī)療器械廠)。

2.1.2 試劑與動(dòng)物:短尾鐵線蓮醇溶物混懸液、齊墩果酸粗提物混懸液(由青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院中藥實(shí)驗(yàn)室制作提供)、新鮮雞蛋1個(gè)、生理鹽水、乙酰水楊酸(吉林省三精醫(yī)藥有限責(zé)任公司，批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H22022732);無(wú)水乙醇、三氯甲烷、吐溫80、濃鹽酸均為分析純;SD大鼠(由青海省地方病防治所提供，動(dòng)物證號(hào):青醫(yī)動(dòng)管:001號(hào))

2.2 實(shí)驗(yàn)用短尾鐵線蓮成分提取:以95%乙醇為溶劑供試液的制備工藝 稱取短尾鐵線蓮400.00g用3924mL95%乙醇超聲提取2h，過(guò)濾得到乙醇提取液，對(duì)藥渣進(jìn)行二次超聲提取，將所得乙醇提取液與前者混合，于60℃水浴鍋加熱一個(gè)夜晚，得到烯醇提取液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃回流，回收乙醇，得浸膏。用三氯甲烷:乙醇=14:6的混合液作為萃取劑，對(duì)浸膏進(jìn)行萃取，得到乙醇提取液、三氯甲烷提取液和殘?jiān)?舍棄)。對(duì)三氯甲烷提取液在微熱條件下邊攪拌邊加熱至45℃，靜置一個(gè)夜晚，加蒸餾水至1:1，加熱蒸發(fā)除去三氯甲烷，與齊墩果酸粗提物分別用95%乙醇溶解，再加熱蒸發(fā)，留出部分樣品備用，將剩余部分加蒸餾水至1:1，加1mL“吐溫80”制得混懸液。

2.3 致炎劑制備:將新鮮雞蛋清與蒸餾水按1:9混合制得致炎劑。

2.4 動(dòng)物分組及給藥:取40只SD大鼠隨機(jī)分為A、B、C、D、E5組，分別為陰性對(duì)照組、乙酰水楊酸陽(yáng)性對(duì)照組、齊墩果酸粗提取物溶液液LD50的1/3給藥量組、乙醇提取液LD50的1/5給藥量組、乙醇提取液LD50的1/3給藥量組。對(duì)每組大鼠編號(hào)、稱重、測(cè)量右后腳踝周長(zhǎng)、計(jì)算給藥量。在給藥1/2h后，對(duì)每只大鼠注射致炎劑。此后，每間隔15min測(cè)量同一部位的周長(zhǎng)〔3〕。

2.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù):實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 SD大鼠右后腳踝周長(zhǎng)變化數(shù)值(cm)

2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:由數(shù)據(jù)可知，短尾鐵線蓮乙醇提取液對(duì)抗腳踝腫脹效果強(qiáng)于復(fù)方乙酰水楊酸的抗炎作用，同時(shí)也比齊墩果酸的抗炎效果好;同一部位提取液不同的給藥劑量在抗炎效果中也起不同作用。

3 高效液相法

3.1 儀器與材料:高效液相色譜儀(日本島津)，LC－10AT泵，ZA－100進(jìn)樣器，N2000工作站，SPD－10A檢測(cè)器，SY1200T超聲波清洗器，ZF－1型三用紫外分析儀。齊墩果酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110773－200811)，試劑除乙腈為色譜純外，其他均為分析純，水為重蒸餾水。

3.2 方法

3.2.1 色譜條件:色譜柱:HYPERSIL(C18200mmx4.6mm，5μm)，流動(dòng)相:乙腈 －0.5% 冰乙酸(85:20)，流速:0.8mL，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，溫度:室溫。

3.2.2 對(duì)照品溶液的制備:精密稱取齊墩果酸對(duì)照品10.08mg，加甲醇定容至50mL，精密吸取5mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，用微孔濾膜(0.45μm)濾過(guò)，取濾液作為對(duì)照品溶液。

3.2.3 齊墩果酸粗提物溶液的制備:取齊墩果酸粗提物，加甲醇定容至50mL，精密吸取5mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，用微孔濾膜(0.45μm)濾過(guò)，取濾液齊墩果酸粗提物作為溶液。

3.2.4 供試品溶液的制備:取原藥短尾鐵線蓮，研細(xì)，精密稱取，置小燒杯中，加入適量甲醇超聲提取30min，過(guò)濾，置25mL容量瓶中，定容后搖勻，作為供試品溶液〔4〕。

3.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密吸取齊墩果酸對(duì)照品溶液2、4、10、16、20μL 依次進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，以色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸線方程:y=227323.17x－193813.14，相關(guān)系數(shù) r=0.9978。表明齊墩果酸在0.2～2.0μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3 結(jié)果:經(jīng)結(jié)果對(duì)比可知:供試品與齊墩果酸對(duì)照品在相同時(shí)間點(diǎn)出峰，說(shuō)明可以采用高效液相色譜法鑒別出短尾鐵線蓮中齊墩果酸的存在。

4 討論

短尾鐵線蓮是獨(dú)具高原特色的常用藏藥之一。藏醫(yī)認(rèn)為短尾鐵線蓮有“提升胃溫;破穿腫瘤，托膿”的作用?！缎螒B(tài)比喻》記載說(shuō)，“鐵線蓮為治寒性腫瘤良藥，味辛、微甘，功效提升胃溫，治腫瘤，引黃水。”中醫(yī)稱該屬黃花鐵線蓮為鐵線透骨草，具有祛風(fēng)濕、止痹痛的功能，鐵線蓮屬藥物威靈仙具有祛風(fēng)除濕，通絡(luò)止痛，消痰水，散癖積的作用。威靈仙所含成分與短尾鐵線蓮相同，應(yīng)與短尾鐵線蓮具有相同作用。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道證明，木犀科植物齊墩果的葉、女貞果實(shí)、龍膽科植物青葉膽全草、傘形科植物大星芹的葉、根中含有相對(duì)豐富的齊墩果酸，具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用〔5〕。本實(shí)驗(yàn)表明，短尾鐵線蓮中主要成分是齊墩果酸，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在對(duì)抗SD大鼠足腫脹試驗(yàn)中，P＜0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這與藏醫(yī)學(xué)中相關(guān)醫(yī)學(xué)的文獻(xiàn)記錄相一致。作為毛茛科的藥用植物，短尾鐵線蓮分布廣泛、儲(chǔ)存量大，是獨(dú)具高原特色的藏藥之一，具有良好的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

〔1〕中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所.藏藥志〔M〕.西寧:青海人民出版社，1991.248.

〔2〕羅海燕，余蔥蔥，毛羽.薄層掃描法測(cè)定亮舒片中齊墩果酸的含量〔A〕.?？?中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2007，07(3):1087～1089.

〔3〕吳論，梅全喜，鐘希文，等.濃薄荷水對(duì)雞蛋清致大鼠足趾腫脹影響的實(shí)驗(yàn)研究〔R〕.當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2010，21(2):2.

〔4〕李夢(mèng).HPLC法測(cè)定女貞子中齊墩果酸的含量〔A〕.合肥:安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，10525～10526.

〔5〕中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所.中藥志(第一冊(cè))〔M〕.人民衛(wèi)生出版社，1979.201.

〔6〕戴岳等.齊墩果酸的抗炎作用〔J〕.北京:中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，1989，3(2):96.