苗培福 張瑞霞

(2.內(nèi)蒙古烏海市蒙中醫(yī)院，內(nèi)蒙古 烏海016000)

安全性、有效性和質(zhì)量可靠性是藥品屬性的三個(gè)基本要素，蒙藥也不例外。蒙藥是我國(guó)的傳統(tǒng)用藥，攝入汞劑量稍大或長(zhǎng)期少量攝入在體內(nèi)蓄積到一定程度均可引起中毒，損害腎臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)以及泌尿系統(tǒng)〔1〕。近年來(lái)，藥汞含量超標(biāo)問(wèn)題已引起國(guó)內(nèi)外的關(guān)注，為實(shí)現(xiàn)蒙藥現(xiàn)代化，并且使蒙藥走向國(guó)際市場(chǎng)，就必須強(qiáng)化對(duì)蒙藥中可溶性汞含量的測(cè)定和分析〔2〕。

銀朱最早載于《本草綱目》，它是人工制成的赤色硫化汞(HgS)，尚含有微量鉛(Pb)、銅(Cu)、鈉(Na)、鐵(Fe)、鋁(Al)等雜質(zhì)。其味辛，性溫，有毒。具有:攻毒、殺蟲(chóng)、燥濕、劫痰，等功效。銀朱為許多蒙藥成方所應(yīng)用，例如清肺十八味丸。

蒙藥使用的黑辰砂非天然產(chǎn)物，是按1:1比例硫磺炮制銀朱(汞)，在鐵鍋內(nèi)用煤爐加熱至200～300℃左右反復(fù)攪拌形成黑灰色為止，其主要成分是硫化汞，它是蒙藥復(fù)方制劑常用藥材，具有鎮(zhèn)驚、清熱、收斂、破癰等作用，在44%蒙藥水丸劑中配伍使用〔13〕。

銀朱、黑辰砂中的硫化汞是一種較為穩(wěn)定的汞鹽，溶度積為9.3×10～53，在水中幾乎不溶，是一種極難溶的化合物，與其它含汞化合物相比，毒性較低〔4－5〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，銀朱口服后，其中的汞可經(jīng)胃腸道吸收，且吸收量遠(yuǎn)大于按溶度積計(jì)算的理論值。有文獻(xiàn)報(bào)道，銀朱中的硫化汞是不被機(jī)體吸收的無(wú)活性成分(約占給藥量的98%)，而且有活/毒性成分為可溶性汞部分〔6〕。因此本實(shí)驗(yàn)?zāi)M胃腸道實(shí)際情況，系統(tǒng)的比較人工胃液、人工腸液中胃蛋白酶、胰蛋白酶及硫化物對(duì)汞溶出的影響，用雙硫腙分光光度法測(cè)定銀朱、黑辰砂、納米銀朱及蒙藥成方清肺十八味丸在不同化學(xué)體系中可溶性汞的含量，初步研究可能被人體吸收的汞的含量，從而為建立銀朱及含銀朱蒙藥的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和臨床用藥的安全合理性提供依據(jù)〔7－8－9〕。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

RC806溶出試驗(yàn)儀(天大天發(fā));WFJ7200型可見(jiàn)分光光度計(jì)(尤尼柯(上海)儀器有限公司);FA214電子天平(上海?？惦娮觾x器廠);DGG－9240B型智能鼓風(fēng)干燥箱(杭州卓馳儀器有限公司);H1850臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)。

1.2 試劑

胃蛋白酶，胰蛋白酶硫，雙硫腙，鹽酸羥胺，乙二胺四乙酸二鈉，氯仿，氨水，高錳酸鉀，鹽酸，硫酸，硝酸，氫氧化鈉，磷酸二氫鉀等均為分析純。

1.3 藥品

銀朱(湖南省湘潭市滴水化工廠);黑辰砂(內(nèi)蒙古呼和浩特市蒙藥研究所);納米銀朱(內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院無(wú)機(jī)化學(xué)專(zhuān)題室合成);清肺十八味丸(內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司);硝酸汞。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 0.65%(m/V)雙硫腙氯仿貯備液:稱(chēng)取 0.65g雙硫腙溶于100mL三氯甲烷，貯于棕色瓶中，存于暗處。

2.1.2 0.026%(m/V)雙硫腙工作液:吸取2ml雙硫腙貯備液于分液漏斗中，加入2%氨水50mL，振搖萃取，棄去有機(jī)相，水相提取液過(guò)濾后即得。此液需在臨用時(shí)配制。

2.1.3 汞標(biāo)準(zhǔn)貯備液:稱(chēng)取在硫酸銅干燥器中放置過(guò)夜的0.1646g硝酸汞，用去離子水溶解后，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，再用去離子水稀釋至標(biāo)線，搖勻。此溶液每毫升含0.9897mg汞。

2.1.4 汞標(biāo)準(zhǔn)使用溶液:吸取汞標(biāo)準(zhǔn)貯備液1.00mL，注入100mL容量瓶，用1%硝酸溶液稀釋至標(biāo)線，搖勻。此溶液每毫升含9.897μg汞。

2.1.5 人工胃液:用去離子水稀釋13mol·L－1HCl至pH=1.50，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.1.6 胃蛋白酶液:稱(chēng)取1.6g胃蛋白酶溶于10mL0.1mol·L－1HCl，配制成質(zhì)量濃度為 0.16g·mL－1胃蛋白酶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.1.7 人工腸液:稱(chēng)取 KH2PO46.8g，加去離子水500mL溶解，用 0.1mol·L－1NaOH 水溶液調(diào)節(jié) pH 值至 6.8，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.1.8 胰蛋白酶液:稱(chēng)取0.180g胰蛋白酶溶于45mL人工腸液，配制成胰蛋白酶質(zhì)量濃度為0.004g·mL－1的胰蛋白酶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.1.9 含硫人工腸液:稱(chēng)取每份樣品質(zhì)量三分之一的硫粉溶于已配制的人工腸液中，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.1.1010 %(m/V)EDTA溶液:將10g分析純乙二胺四乙酸二鈉用去離子水溶解并稀釋至100ml。

2.1.11 6mol/L NaOH溶液:將24g分析純氫氧化鈉用去離子水溶解并稀釋至100mL。

2.1.12 5%(m/V)KMnO4溶液:將5g分析純高錳酸鉀用去離子水溶解并稀釋至100mL。

2.1.13 10%(m/V)鹽酸羥胺溶液:將10g分析純鹽酸羥胺用去離子水溶解并稀釋至100mL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

于 8個(gè) 50ml容量瓶中，分別加入 1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00mL 的汞標(biāo)準(zhǔn)使用液，每個(gè)容量瓶中加入10mL10%(m/V)EDTA溶液，搖勻后加入 8ml 6mol/L NaOH溶液，搖勻后加入2mL 0.026%(m/V)雙硫腙工作液，用去離子水稀釋至標(biāo)線，搖勻，于551nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以試劑空白為參比，于551nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

表1 汞標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

回歸方程:在0.2～1.6(?μ/ml)范圍內(nèi)線性關(guān)系為:A=0.2955c+0.0127，r=1.0442.

2.3 銀朱、黑辰砂、納米銀朱、清肺十八味丸、硝酸汞的溶出

準(zhǔn)確稱(chēng)取銀朱、黑辰砂、納米銀朱、清肺十八味丸，硝酸汞一定量 (均做3個(gè)平行樣)，與不同溶出液500ml混合，將放于37℃，100r·min－1振搖，人工胃液、胃蛋白酶液中2h，人工腸液、胰蛋白酶液、含硫人工腸液中8h。再在室溫下，5000r·min－1離心10min，取上清液(除胃蛋白酶液組和胰蛋白酶液組)，待測(cè);胃蛋白酶液組和胰蛋白酶液組則是先靜置至溶液分3層，將上清液和下層沉淀?xiàng)壢?，取中層含絮狀沉淀的溶出液，在室溫下?000r·min－1離心10min，取上清液，待測(cè)。

為研究pH、蛋白質(zhì)以及硫化物的影響，溶出液分別為用鹽酸和磷酸鹽緩沖液配制的不同pH的溶液，含不同蛋白質(zhì)胃蛋白酶(pepsin)，胰蛋白酶(trypsin)的溶液及一定濃度的含硫人工腸液。

2.4 可溶性汞含量的測(cè)定

分別吸取25.00ml溶出液(除硝酸汞組)于50ml容量瓶中，依次加入10%(m/V)EDTA 10.00ml，6mol/L NaOH 8.00mL，0.026%(m/V)雙硫腙工作液 2.00mL，用去離子水稀釋至標(biāo)線。以相應(yīng)的試劑空白為參比，在551nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

表2 胃液、胃蛋白酶液中藥品溶出數(shù)據(jù)

表3 腸液、胰蛋白酶液、含硫腸液中藥品溶出數(shù)據(jù)

3 討論

3.1 pH對(duì)汞溶出的影響

試驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表4)表明，pH對(duì)銀朱、黑辰砂、納米銀朱和清肺十八味丸中汞的溶出量有較大的影響，隨著 pH的降低，汞的溶出量明顯增加。人工胃液中(pH=1.5)汞的溶出量明顯大于人工腸液(pH=6.8)。這可能是由于銀朱礦物中含有了其他形式的汞化合物雜質(zhì)而造成的。

表4 人工胃液和人工腸液汞溶出量比較

3.2 胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)汞溶出的影響

在消化道存在胃蛋白酶和胰蛋白酶，這些物質(zhì)特別是含巰基的物質(zhì)對(duì)于汞均有結(jié)合能力。因此本試驗(yàn)研究了胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)銀朱、黑辰砂、納米銀朱和清肺十八味丸中汞的溶出量的影響，試驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表5)表明，胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)汞溶出量有一定的促進(jìn)作用，但是不夠明顯。

3.3 硫?qū)艹龅挠绊?/h3>

由于腸內(nèi)經(jīng)細(xì)菌代謝后會(huì)產(chǎn)生硫化物，而HgS具有與硫形成多硫化物的性質(zhì)，所以本試驗(yàn)研究了人工腸液中加入硫粉對(duì)汞溶出的影響。試驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表6)表明，人工腸液中加入硫粉對(duì)銀朱、黑辰砂、納米銀朱和清肺十八味丸中汞的溶出有較強(qiáng)的助溶作用。

表5 人工胃液和人工腸液加酶前后汞溶出量比較

表6 人工腸液和加硫人工腸液汞溶出量比較

在人體腸道內(nèi)存在形成汞多硫化物的條件，包括弱堿性環(huán)境和腸內(nèi)細(xì)菌分解所產(chǎn)生的大量 H2S(主要以 HS－的形式存在)。因此可以推測(cè)，多硫化汞配合物可能是銀朱在體內(nèi)的一種重要形式。

3.4 溶出液中微粒的存在和粒度分布對(duì)汞溶出的影響

為觀察HgS溶出的形式是可溶性物質(zhì)還是懸浮微粒，分別對(duì)銀朱和納米銀朱在人工胃液、胃蛋白酶液、人工腸液、胰蛋白酶液和含硫人工腸液進(jìn)行溶出試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表7)表明，含硫人工腸液對(duì)納米銀朱中汞溶出的影響顯著，汞的溶出量約為銀朱中的15倍。

表7 銀朱和納米銀朱汞溶出量比較

4 結(jié)論

通過(guò)比較胃腸道中存在的各種化學(xué)因素對(duì)銀朱、黑辰砂、納米銀朱、清肺十八味丸中汞溶出的影響，得結(jié)果為pH對(duì)汞溶出量有較大的影響，蛋白質(zhì)的促溶作用有限，硫?qū)艹隽康挠绊戯@著高于其他，納米銀朱對(duì)含硫人工腸液中汞溶出的影響顯著。提示銀朱在腸道中的形式可能為汞的各種含硫配合物;至于汞的含硫配合物能否在腸道中吸收并發(fā)揮藥理作用還有待進(jìn)一步去證實(shí)。

〔1〕梁愛(ài)華，商敏鳳.朱砂的毒性研究概況〔J〕.中國(guó)中藥雜志，2005，30(4):249.

〔2〕陳飛霞，魏世強(qiáng).汞的毒理學(xué)研究進(jìn)展〔J〕.云南環(huán)境科學(xué)，2005，24(增刊1):14－17.

〔3〕梁國(guó)剛，張啟偉.朱砂、雄黃中各成分的溶解度對(duì)其藥效、毒副作用的影響〔J〕.中國(guó)中藥雜志，2002，27(5):391.

〔4〕Jenny A J，F(xiàn)ran coisM M，H arold F H .Mercury speciation in the presence of poly slfid es〔J〕.Environ Sci Technol，2000，34:2196.

〔5〕曾克武，王旗，楊曉達(dá)，等.朱砂溶出的體外研究〔J〕.中國(guó)中藥雜志，2007，32(3):233.

〔6〕倪坤儀，耿惠珍，程光，等.雙硫腙水相比色法測(cè)定含朱砂中成藥中微量汞〔J〕.中國(guó)藥科大學(xué)報(bào)，1996，27(12):726.

〔7〕齊惠杰，琳靜，等.特色蒙藥材黑辰砂物理常數(shù)與組分測(cè)定〔J〕.中國(guó)民族醫(yī)藥雜志.2008，12:60.

〔8〕任大喜，郭鸰，霍貴成.體外模擬法研究生物利用率的影響因素〔J〕.食品科技，2007，3:12.

〔9〕梁淑軒，龐秀言.人體內(nèi)汞分子形態(tài)的轉(zhuǎn)化〔J〕.河北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1999，3(19):1.