朱思晗， 常曉慧， 王玲玲， 李欣然， 陳曉霞*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600；2.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第967醫(yī)院，遼寧大連 116021)

伊馬替尼是一種有效的酪氨酸激酶選擇性口服信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑[1]，可通過(guò)抑制 Bcr -Abl酪氨酸激酶，選擇性抑制 Bcr -Abl 陽(yáng)性細(xì)胞系細(xì)胞、急性淋巴細(xì)胞白血病患者的新鮮細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，用于治療慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic Myelogenous Leukemia，CML)[2]。該藥物口服吸收好，絕對(duì)生物利用度超過(guò)97%[3]，使患者生存率得到大大提高。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期服用伊馬替尼可引起男性慢粒患者精子數(shù)量減少并出現(xiàn)畸形[4]。

金匱腎氣丸出自《金匱要略》，是漢代醫(yī)圣張仲景所創(chuàng)著名方劑，由附子、肉桂、熟地黃、山藥、山茱萸、牡丹皮、茯苓、澤瀉等組成。該方劑配伍嚴(yán)謹(jǐn)，療效顯著，被稱(chēng)為“補(bǔ)腎諸方之祖”，深受歷代醫(yī)家推崇，至今仍在臨床上廣泛應(yīng)用[5]。金匱腎氣丸可通過(guò)補(bǔ)腎陽(yáng)作用，改善小鼠精子畸形率、活動(dòng)度等[6]。但是中藥成分復(fù)雜，與西藥共同服用時(shí)，需要充分考慮藥物間相互作用。有研究報(bào)道伊馬替尼在體內(nèi)經(jīng)多種 CYP450 代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體作用，在合并用藥過(guò)程中易發(fā)生藥動(dòng)學(xué)的相互作用[7 - 9]。本實(shí)驗(yàn)以體外模擬胃/腸液為環(huán)境，將伊馬替尼與不同濃度金匱腎氣丸共同作用不同時(shí)間，通過(guò)考察人工胃/腸液中伊馬替尼及金匱腎氣丸中主要化學(xué)成分，研究不同濃度金匱腎氣丸與伊馬替尼相互作用，為進(jìn)一步體內(nèi)分析及二者的合理用藥奠定理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

安捷倫1100高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)，安捷倫)；BSA2224S分析天平(德國(guó)，賽多利斯)。

伊馬替尼對(duì)照品(純度99.3%，中國(guó)藥品生物制藥檢定所)；莫諾苷、馬錢(qián)苷、丹皮酚對(duì)照品(純度均≥98.0%，成都曼斯特生物科技有限公司)；胃蛋白酶、胰酶均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)北京試劑有限公司；甲磺酸伊馬替尼片(瑞士諾華制藥公司)；乙腈(色譜純，大連銘揚(yáng)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司)；其他試劑均為分析純。娃哈哈純凈水。

金匱腎氣丸(北京同仁堂制藥有限公司)。

1.2 溶液的制備

對(duì)照品溶液制備：精密稱(chēng)取各對(duì)照品適量并溶于甲醇，分別配制成含伊馬替尼、莫諾苷、馬錢(qián)苷、丹皮酚質(zhì)量濃度為2.000 mg/mL的儲(chǔ)備溶液。

空白基質(zhì)制備：取胰蛋白酶或胃蛋白酶0.1 g，置于50 mL燒杯中，加入10 mL水充分溶解后，加熱煮沸10 min，得到滅活的胰蛋白酶或胃蛋白酶溶液。將以上兩種溶液混合后，加入34 mg KH2PO4，加水定容至25 mL 容量瓶中，即為空白基質(zhì)溶液。取空白基質(zhì)溶液1 mL，加入200 μL乙腈渦旋混勻1 min，4 ℃下以20 000 r/min離心10 min。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別取適量的各對(duì)照品儲(chǔ)備液，以空白基質(zhì)稀釋至含伊馬替尼、莫諾苷、馬錢(qián)苷、丹皮酚濃度分別為200、80、20、30 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次稀釋為4個(gè)梯度混合標(biāo)品，按“1.3”色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積。

人工胃液的制備：按文獻(xiàn)方法[10]，取16.4 mL稀HCl，加水800 mL、胃蛋白酶10 g，搖勻使其溶解，用0.1 moL/L HCl調(diào)pH至1.3，再加水稀釋并定容至1 000 mL，即得人工胃液。

人工腸液的制備：按文獻(xiàn)方法[10]，取6.8 g KH2PO4，加水500 mL，搖勻使其溶解，用0.1 moL/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.8；另稱(chēng)取胰蛋白酶10 g，加適量水溶解；將上述兩種溶液混合后，再加水稀釋并定容至1 000 mL，即得人工腸液。

人工胃/腸液下伊馬替尼樣品配制：取伊馬替尼原藥粉末10.00 mg,加入人工胃/腸液50.00 mL，振蕩混勻，37 ℃水浴孵育，分別在反應(yīng)0、2、4、8、12 h時(shí)取反應(yīng)液1.0 mL，加入0.2 mL乙腈進(jìn)行沉淀，然后在5 000 r/min離心10 min，取上清液，用微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液進(jìn)行色譜分析。

人工胃/腸液下金匱腎氣丸樣品配制：分別取金匱腎氣丸大蜜丸粉末0.3、0.6、1.2、2.4、3.6 g，加入人工胃/腸液50.00 mL，振蕩混勻，37 ℃水浴孵育，分別在反應(yīng)0、2、4、8、12 h時(shí)取反應(yīng)液1.0 mL，加入0.2 mL 乙腈進(jìn)行沉淀，5 000 r/min離心10 min，取上清液用微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液進(jìn)行色譜分析。

人工胃/腸液下伊馬替尼+不同濃度金匱腎氣丸樣品配制：取伊馬替尼片、金匱腎氣丸粉末適量，按伊馬替尼片10.00 mg分別添加金匱腎氣丸0.3、0.6、1.2、2.4、3.6 g的比例配制樣品，分別加入人工胃/腸液50.00 mL，振蕩混勻，37 ℃水浴孵育，分別在反應(yīng)0、2、4、8、12 h時(shí)取反應(yīng)液1.0 mL，加入0.2 mL乙腈進(jìn)行沉淀，以5 000 r/min離心10 min，取上清液，用微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液進(jìn)行色譜分析。

1.3 色譜條件

安捷倫ODS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)和0.3%H3PO4水溶液(B)。梯度洗脫(0～5 min，95%～92%B；5～20 min，92%B；20～35 min，92%～72%B；35～55 min，72%～40%B；55～60 min，40%B)；流速為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法性能指標(biāo)考察

2.1.1 線性范圍及定量限考察將標(biāo)準(zhǔn)溶液在優(yōu)化色譜條件下檢測(cè)，以各對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)(y)，濃度為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表1列出了各化合物的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(R)及定量限。

表1 化合物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(R)及定量限Table 1 Linear equantions,linear ranges, correlation coefficients(R) and limit of quantification(LOQ) of the determined compounds

2.1.2 儀器精密度考察取線性項(xiàng)下含伊馬替尼濃度分別為12.50、50.00、200.00 μg/mL，3個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄1 d內(nèi)重復(fù)測(cè)定6次以及連續(xù)6 d測(cè)定譜圖，各待測(cè)化合物的日內(nèi)及日間精密度(RSD)均<2.0%。

2.1.3 方法準(zhǔn)確度考察取伊馬替尼原料藥5 mg及金匱腎氣丸樣品1.8 g，分別加入(低、中、高)三個(gè)不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.2”人工胃液下伊馬替尼+不同濃度金匱腎氣丸樣品配制方法處理后，各取10 μL注入液相色譜儀，計(jì)算回收率(表2)。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)Table 2 Results of recovery test(n=5)

2.2 伊馬替尼與金匱腎氣丸在人工胃/腸液中相互作用研究

分別取混合對(duì)照品溶液、人工胃液、人工腸液、人工胃/腸液下伊馬替尼樣品、人工胃/腸液下金匱腎氣丸、人工胃/腸液下伊馬替尼+金匱腎氣丸樣品各10 μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，平行測(cè)定3次。由圖1可見(jiàn)，人工胃/腸液對(duì)樣品測(cè)定不存在干擾，混合標(biāo)準(zhǔn)品在各樣品中分離度好，適用于伊馬替尼與金匱腎氣丸在人工胃/腸液中相互作用研究測(cè)定。

圖1 4種標(biāo)準(zhǔn)品及測(cè)試樣品的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms obtained for mixed standards and samplesA.Standards(1.Morroniside；2.Loganin；3.imatinib；4.Paenonl)；B.Simulated gastric fluid(SGF)；C.Simulated intestinal fluid(SIF)；D.Imatinib(IM) in SGF；E.Jingui shenqi Pill (JG,3.6 g)in SGF；F.IM+JG(3.6 g)in SGF；G.IM in SIF；H.JG (3.6 g)in SIF；I.IM+JG(3.6 g)in SIF.

由圖2可知，10.00 mg 伊馬替尼中加入不同量的金匱腎氣丸后，人工胃/腸液中伊馬替尼濃度隨著金匱腎氣丸加入量增加，當(dāng)達(dá)到3.6 g時(shí)伊馬替尼含量顯著下降，與未加入金匱腎氣丸相比P<0.01；但低濃度金匱腎氣丸對(duì)其含量幾乎沒(méi)有影響(圖2A)。

在人工胃/腸液中伊馬替尼與不同濃度的金匱腎氣丸共同孵育后，與金匱腎氣丸單獨(dú)孵育相比，丹皮酚含量幾乎不受伊馬替尼影響(圖2D)。

不同濃度金匱腎氣丸中馬錢(qián)苷含量隨伊馬替尼加入降低，當(dāng)金匱腎氣丸量高于1.2 g時(shí)，馬錢(qián)苷含量降低十分顯著(圖2C)。

人工胃液中莫諾苷不受伊馬替尼影響；人工腸液中，金匱腎氣丸量高于2.4 g時(shí)，莫諾苷含量降低(圖2B)。

圖2 人工胃/腸液中伊馬替尼與不同濃度金匱腎氣丸相互作用后主要成分濃度變化Fig.2 Concentration changes of main components after interaction between imatinib and Jingui shenqi Pill in SGF/ SIFNotes:A.in SGF，inner is in SIF；**P<0.01 indicates JG+IM showed statistically significant differences from IM with same concentration；#P<0.05 indicates JG+IM showed statistically significant differences from JG with same concentration in SGF；&P<0.05 indicates JG+IM showed statistically significant differences from JG with same concentration in SIF.

伊馬替尼用于治療對(duì)干擾素治療失敗的白血病患者，臨床初期使用劑量為600 mg/d，穩(wěn)定后持續(xù)服用推薦最佳使用劑量為400 mg/d。考慮臨床實(shí)際情況，患者急變期以治療為主，不適宜服用金匱腎氣丸，后期維持治療中，可以服用金匱腎氣丸來(lái)降低伊馬替尼生殖毒性，提高生活質(zhì)量。因此本實(shí)驗(yàn)中選擇臨床日推薦服用量分別為400 mg伊馬替尼與12 g金匱腎氣大蜜丸，進(jìn)行折算為10.00 mg：0.3 g進(jìn)行研究。

為了更好的探討金匱腎氣丸可能對(duì)伊馬替尼穩(wěn)定性影響，設(shè)計(jì)了更高劑量組。由實(shí)驗(yàn)可知，當(dāng)金匱腎氣丸超過(guò)12倍以上會(huì)對(duì)伊馬替尼在胃腸中穩(wěn)定性造成影響，按照醫(yī)囑不會(huì)達(dá)到該劑量，即使考慮藥物殘留影響，累積濃度也達(dá)不到如此高，因此我們推測(cè)金匱腎氣丸不會(huì)影響胃腸中伊馬替尼消化吸收，能夠保存藥物活性。但伊馬替尼對(duì)金匱腎氣丸中苷類(lèi)化合物溶出有抑制作用，尤其是馬錢(qián)苷，藥物之間相互作用關(guān)系復(fù)雜，有待進(jìn)一步深入研究。因此，為了避免伊馬替尼體內(nèi)抑制金匱腎氣丸中主要苷類(lèi)成分溶出而降低藥效，建議兩者間隔2 h以上服用。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種穩(wěn)定性好、精密度及準(zhǔn)確度高的測(cè)定伊馬替尼與金匱腎氣丸中主要成分含量的測(cè)定方法。并用該方法分析了將伊馬替尼及金匱腎氣丸同時(shí)孵育于人工胃/腸液后不同時(shí)間，伊馬替尼及金匱腎氣丸中主要有效成分含量變化。發(fā)現(xiàn)伊馬替尼及金匱腎氣丸同時(shí)使用時(shí)，主要影響金匱腎氣丸中苷類(lèi)成分莫諾苷和馬錢(qián)苷含量，尤其是含量較低的馬錢(qián)苷。因此為了避免伊馬替尼及金匱腎氣丸同時(shí)服用降低金匱腎氣丸療效，我們建議金匱腎氣丸謹(jǐn)遵說(shuō)明書(shū)使用，一次一丸，每日兩次服用，與伊馬替尼聯(lián)合使用時(shí)，間隔2 h以上服用。