向 琴， 董海峰， 張學(xué)記

(深圳大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，廣東深圳 518061)

1 前言

自然界一切生命現(xiàn)象都與酶有關(guān)。天然酶作為一種強(qiáng)大的生物催化劑，因其優(yōu)異的催化活性和特異性而在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化工、食品領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用[1 - 4]。然而天然酶主要由蛋白質(zhì)和生物有機(jī)分子組成，易受外界酸、堿、溫度等條件影響，并且生產(chǎn)成本高，阻礙了其實(shí)際應(yīng)用。酶模擬物，尤其是納米酶，在替代天然酶方面具有至關(guān)重要的作用。納米酶是一類(lèi)既有納米材料的獨(dú)特性能，又有類(lèi)似天然酶的催化效率和酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的人工模擬酶[5 - 8]。納米酶具有良好的穩(wěn)定性、制備成本低、儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，能有效避免天然酶制備和純化過(guò)程中的復(fù)雜性，可應(yīng)用于生物檢測(cè)、腫瘤治療以及其他類(lèi)酶催化反應(yīng)(圖1)[9 - 14]。然而與天然酶相比，其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和催化機(jī)理都十分復(fù)雜，嚴(yán)重制約了它的快速發(fā)展。隨后有研究表明，納米酶的尺寸對(duì)其催化性能起著至關(guān)重要的作用，由于低配位金屬原子通常作為活性部分，每個(gè)金屬原子的催化活性隨著金屬顆粒尺寸的減小而相應(yīng)提高，并且通過(guò)實(shí)驗(yàn)和理論分析，驗(yàn)證了亞納米尺寸的金屬團(tuán)簇具有更高的催化活性和選擇性。

圖1 單原子納米酶在生物醫(yī)學(xué)中應(yīng)用示意圖Fig.1 Illustration of SAzymes in biomedical applications

為進(jìn)一步推進(jìn)納米酶的發(fā)展，新出現(xiàn)的單原子納米酶(SAzymes)，集成了單原子技術(shù)和固有的類(lèi)酶活性位點(diǎn)，將納米酶技術(shù)提升到原子水平，并為突破其固有的局限性提供了新的機(jī)遇[15 - 20]。SAzymes中，原子分散的金屬中心最大限度地提高了原子利用效率和活性位點(diǎn)密度，具有比傳統(tǒng)納米酶高10～100倍的優(yōu)異催化活性[21]，并且通過(guò)精確調(diào)節(jié)原子的空間構(gòu)型可以設(shè)計(jì)出同時(shí)具有多種酶催化活性的金屬配位結(jié)構(gòu)，展現(xiàn)出廣泛的催化選擇性，為其實(shí)際應(yīng)用提供了廣闊的前景。

2 單原子納米酶的特征

2.1 單原子納米酶的結(jié)構(gòu)優(yōu)點(diǎn)

基于SAzymes的類(lèi)酶催化反應(yīng)是一種特殊的多相催化反應(yīng)，其催化活性和選擇性是最重要的考察因素，這在很大程度上取決于納米材料的結(jié)構(gòu)和原子特性[22 - 23]。然而，對(duì)于傳統(tǒng)納米酶，其活性主要來(lái)源于納米材料表面極少的活性位點(diǎn)，如邊緣、缺陷位點(diǎn)中的不飽和配位原子[24]。這些位點(diǎn)結(jié)構(gòu)難以區(qū)分和定量控制，不僅使催化機(jī)理極其復(fù)雜，還導(dǎo)致其與天然酶的活性相差甚遠(yuǎn)。大量的研究表明，較小尺寸的納米酶會(huì)因較高的表面體積比而暴露出更多的催化活性位點(diǎn)，從而提高催化活性[25 - 26]。當(dāng)納米粒子縮小到原子水平時(shí)，可以表現(xiàn)出與納米顆粒顯著不同的幾何和電子效應(yīng)，不僅具有最高的原子利用率，并且原子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，表現(xiàn)出明確的配位結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)、催化機(jī)理以及優(yōu)越的催化性能。SAzymes可以填補(bǔ)均相催化與多相催化之間的空白，突破材料設(shè)計(jì)的局限[27]。

2.2 單原子納米酶的表面優(yōu)化

通常，合成的SAzymes具有較高的表面能，對(duì)其表面進(jìn)行修飾，能改變對(duì)底物的親和力，改善疏水性，增加靶向性，并提高其催化效率[28 - 30]。在SAzymes的表面進(jìn)行適當(dāng)?shù)木垡叶?PEG)修飾，不僅可以增強(qiáng)其在溶液中的分散性和生物相容性，而且可以防止SAzymes與生物液體組分相互作用，從而延長(zhǎng)血液循環(huán)，降低單核吞噬系統(tǒng)的清除率。Huo等[27]使用DSPE-PEG作為表面活性劑，使得Fe -N4SAzymes在生理鹽水中具有良好的分散性，顯著提高了對(duì)腫瘤的抑制作用；同樣，Xu等[31]使用PEG共軛維生素E改善了Zn-N4催化劑在溶液中的分散性。除了PEG，Wang等[29]利用PVP作為穩(wěn)定劑，使錨定Ru原子的Mn3[Co(CN)6]2在水溶液中具有較好的分散性，提高了其用于癌癥光動(dòng)力學(xué)治療的效率。

此外，使用靶向配體修飾于SAzymes表面，可以提高SAzymes與細(xì)胞表面的特異性相互作用，有利于對(duì)病灶位點(diǎn)的特異性選擇。常用的靶向修飾物有生物小分子、肽、抗體或蛋白質(zhì)等，通過(guò)與細(xì)胞表面受體結(jié)合，然后由受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)有效靶向癌細(xì)胞[27,32,33]。例如利用EDC/NHS化學(xué)偶聯(lián)法，將三苯基膦(TPP)上的羧基與所制備的碳點(diǎn)上的胺共價(jià)偶聯(lián)，可以得到穩(wěn)定的靶向線粒體的Au-碳點(diǎn)結(jié)構(gòu)，而且具有原子分散的Au，可以實(shí)現(xiàn)最大程度地與內(nèi)源性谷胱甘肽(GSH)反應(yīng)，降低GSH水平，放大線粒體內(nèi)活性氧(ROS)水平，進(jìn)而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[34]。

3 單原子納米酶在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

3.1 單原子納米酶用于生物傳感

SAzymes具有高選擇性和優(yōu)異的催化活性，有利于應(yīng)用于生物傳感[30,35-40]。Jiao等[41]通過(guò)摻雜B元素精確調(diào)控中心Fe原子的配位環(huán)境，開(kāi)發(fā)出一種B摻雜的Fe-N-C單原子納米酶(FeBCN)，其具有與天然辣根過(guò)氧化物酶(HRP)相似的結(jié)構(gòu)(圖2(A))，表現(xiàn)出比HRP更高的溫度耐受性以及顯著增強(qiáng)的類(lèi)過(guò)氧化物酶(POD)活性和選擇性。通過(guò)pH調(diào)節(jié)FeBCN的POD活性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)乙酰膽堿酯酶(AChE)活性及其相應(yīng)的抑制劑分子的高靈敏檢測(cè)。證明了SAzymes能有效模擬天然酶，在生物酶活性和小分子檢測(cè)中顯示良好的應(yīng)用前景。

除了利用單原子Fe構(gòu)建納米酶催化位點(diǎn)，Cu離子同樣可以用于構(gòu)建SAzymes。Zhu課題組[35]通過(guò)鹽模板策略，在摻N碳納米片上嵌入高濃度Cu單原子位點(diǎn)，合成了具有POD活性的Cu-NC SAzymes。然后將Cu-NC SAzymes與AChE和膽堿氧化酶(ChOx)結(jié)合，構(gòu)建了基于三酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系(圖2(D))，通過(guò)顯色法可以檢測(cè)痕量的乙酰膽堿，線性檢測(cè)范圍為10～8 000 μmol/L，檢出限為1.24 μmol/L。

圖2 FeBCN(A)[41]、Fe -N-C(B)[36]、Cu-N-C(D)[42]結(jié)構(gòu)示意圖以及Fe/NC-SAzymes[35]對(duì)ALP的檢測(cè)(C)Fig.2 Structure diagram of FeBCN(A)[41]，F(xiàn)e -N-C(B)[36] ，Cu-N-C(D)[42] and UV-Vis absorption spectra of the Fe/NC-SAzymes/H2O2/TMB/AAP system with various concentrations of ALP(U/L) and Plots of the absorbance of the assay based on Fe/NC-SAzymers[35] versus ALP activity at 652 nm(C)

3.2 單原子納米酶用于腫瘤治療

圖3 Mn/PSAE催化H2O2分解O2(A)；TMB法測(cè)定不同pH下Mn/PSAE的類(lèi)氧化酶活性(B)[28]；Cu-HNCS用于小鼠后的腫瘤生長(zhǎng)曲線(C)和腫瘤抑制率(D)[50]；OxgeMCC-r SAE分解H2O2的能力(E)[29]；不同濃度MitoCAT-g處理后單個(gè)HepG-2細(xì)胞中的氧通量(F)[34]。Fig.3 The O2 generation from the decomposition of H2O2 by Mn/PSAE-mediated catalysis (A);TMB assay for measuring oxidase-like activity of the Mn/PSAE at the different pH(B) [28];Tumor proliferation curves (C) and relative tumor inhibition rates (D) after treatment with Cu-HNCS [50];Degradation profiles of H2O2 with or without of OxgeMCC-r SAE(E)[29];Representative traces of oxygen flux in single HepG-2 cells after treatment with different concentrations of MitoCAT-g(F)[34].

除了催化產(chǎn)生ROS，有效降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)的含量，同樣可以破壞細(xì)胞內(nèi)的氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)，從而引起ROS相對(duì)增加，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。例如，Gong等[34]開(kāi)發(fā)了一種碳點(diǎn)支撐的原子尺度分散的金(CAT-g)，這種納米材料可以有效清除線粒體中的GSH，并增加ROS，經(jīng)過(guò)瘤內(nèi)注射后，可以顯著殺傷癌細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)不損傷正常組織。并且，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，修飾了三苯基膦(TPP)的MitoCAT-g可以降低癌細(xì)胞線粒體膜電位和氧消耗，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

3.3 單原子納米酶用于抗菌作用

ROS可以破壞細(xì)菌的活性組分，造成其細(xì)胞膜、核酸、蛋白質(zhì)等損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[21,52 - 53]。目前報(bào)道的納米酶主要介導(dǎo)氧化還原反應(yīng)，可以調(diào)節(jié)ROS水平，用于開(kāi)發(fā)新型的抗菌藥物。例如，Huo等[51]將單原子Fe錨定在氮摻雜無(wú)定形碳上，制備了碳基單原子Fe催化劑(SAF NCs)，該納米材料具有優(yōu)異的POD活性，在生理水平濃度(50～100×10-6)的H2O2存在下，可以產(chǎn)生豐富的 ·OH，具備殺死革蘭氏陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌)和革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)的能力。利用SAF NCs和H2O2處理細(xì)菌后，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的存活性僅為28.9%和17.4%，并且此單原子催化劑對(duì)近紅外光具有特異性吸收，表現(xiàn)出19.37%的光熱轉(zhuǎn)化效率，在近紅外光照射下，對(duì)兩種菌落的抗菌效率均提高到接近100%，可以協(xié)同殺死細(xì)菌。類(lèi)似的，Liu課題組[31]利用金屬有機(jī)框架(MOFs)材料ZIF-8，通過(guò)介孔硅裂解保護(hù)策略，制備了單原子Zn催化劑，通過(guò)酶學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其可作為一種高效的單原子POD模擬物，可應(yīng)用于傷口消毒。在體外抗菌實(shí)驗(yàn)中，該SAzymer實(shí)現(xiàn)了高達(dá)99.85%的抑菌率，同時(shí)能夠在低濃度H2O2情況下有效促進(jìn)小鼠傷口的愈合。此外，Huang等[54]制備了一種能模擬細(xì)胞色素P450的單原子納米酶(FeN5-SA/CNF)，以Zn基MOFs包裹鐵酞菁作為前驅(qū)體，高溫?zé)峤庑纬蒄eN5/C位點(diǎn)，該位點(diǎn)具有優(yōu)異的OXD活性。體外抗菌實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)FeN5SA/CNF處理的大腸桿菌細(xì)胞的存活率明顯降低，細(xì)菌形態(tài)受到嚴(yán)重?fù)p傷。并且FeN5SA/CNF對(duì)小鼠的潰瘍情況具有明顯的緩解作用，可以加速傷口愈合。

3.4 單原子納米酶的抗氧化應(yīng)激作用

圖4 (A)FeN5SAzymes/CNF的形成示意圖[54];(B)單原子Pt/CeO2納米酶繃帶對(duì)小鼠腦外傷的無(wú)創(chuàng)治療[58]。Fig.4 (A)Schematic formation process of carbonnanoframe-confined atomically dispersed Fe sites with axial five-N coordination for mimicking the active center of cytocrome P450[54];(B)Noninvasive treatment of brain trauma in mouse models using the nanozyme-based bandage [58].

4 結(jié)論與展望

SAzymes具有均勻分散的活性位點(diǎn)和明確的配位結(jié)構(gòu)，能夠模擬多種天然酶的活性，可用于生物的檢測(cè)與疾病的治療。未來(lái)應(yīng)進(jìn)一步探索SAzymes的活性-結(jié)構(gòu)關(guān)系，合理地調(diào)節(jié)催化活性位點(diǎn)的幾何和電子性質(zhì)，從而設(shè)計(jì)出效率更高的納米酶；應(yīng)拓展金屬原子的種類(lèi)，開(kāi)發(fā)除Fe、Zn、Au金屬原子以外的SAzymes，深入挖掘其潛力；應(yīng)著眼于加強(qiáng)SAzymes的反應(yīng)特異性和優(yōu)化催化性能，研究納米酶在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)、降解、代謝、劑量依賴毒理性以及生物相容性等，實(shí)現(xiàn)SAzymes的臨床使用。SAzymes的高催化性與選擇性以及優(yōu)異的穩(wěn)定性，為開(kāi)發(fā)可持續(xù)、經(jīng)濟(jì)、安全的疾病治療方法提供了新思路。也預(yù)示了SAzymes在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域巨大的應(yīng)用前景，但也存在如下一些挑戰(zhàn)：

(1)目前已報(bào)道的SAzymes多基于碳基材料，其合成方法主要是通過(guò)高溫?zé)峤猓欢?jīng)過(guò)高溫煅燒的碳材料水溶性和生物相容性差，難以直接應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，雖然可以通過(guò)表面修飾改善其疏水性，但同時(shí)可能對(duì)納米材料的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)造成破壞，加大對(duì)催化機(jī)理的研究難度，故未來(lái)需拓展負(fù)載單原子材料的種類(lèi)。

(2)單原子納米材料的金屬負(fù)載量仍然是目前亟待解決的難題之一，開(kāi)發(fā)高效合理的合成方法，減小負(fù)載材料的尺寸，加強(qiáng)金屬原子的分散，以最大程度的提高金屬原子的負(fù)載量是未來(lái)研究的方向之一，并且可以開(kāi)展雜原子(N/S/B/P)摻雜，以及設(shè)計(jì)多金屬中心的SAzymes，以追求發(fā)揮SAzymes最大的功效。

(3)應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的中心原子主要基于Fe、Zn、Au，并多以M-N-C形式存在，而對(duì)其它金屬原子研究甚少，造成了SAzymes的活性單一，未來(lái)還需開(kāi)發(fā)對(duì)貴金屬、稀有金屬的研究，擴(kuò)大SAzymes的研究范圍。

(4)為早日實(shí)現(xiàn)SAzymes的臨床轉(zhuǎn)化，需特別重視材料的生物安全性，提高材料的生物相容性和生物可降解性，深入探究納米酶在體內(nèi)的作用機(jī)制，建立完備的納米酶毒性評(píng)估平臺(tái)，最終實(shí)現(xiàn)低毒、高效納米酶制劑的開(kāi)發(fā)。