常 瑛，李彥榮

（甘肅省農(nóng)墾農(nóng)業(yè)研究院，甘肅 武威 733006）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）為茄科茄屬植物，是我國(guó)重要的糧、經(jīng)、飼兼用作物，在我國(guó)分布廣泛，栽培面積占世界第2位。甘肅省馬鈴薯常年播種面積達(dá)60萬hm2以上，約占全國(guó)播種面積的10%，列西北五省第1位，是我國(guó)馬鈴薯主要生產(chǎn)及加工基地之一[1]。近年來，隨著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，播種面積逐年擴(kuò)大，產(chǎn)生了較好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。但由于馬鈴薯是無性繁殖作物，經(jīng)過多年留種種植后，體內(nèi)病毒如馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）、馬鈴薯X病毒（PVX）、馬鈴薯Y病毒（PVY）、馬鈴薯S病毒（PVS）、馬鈴薯M病毒（PVM）和類病毒（PSTV）等逐代傳遞并積累，使馬鈴薯植株矮化，莖稈細(xì)弱，葉片失綠、卷曲或皺縮，薯塊變小或畸形而減產(chǎn)30%～50%，對(duì)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的危害。自1955年法國(guó)Monel首次采用馬鈴薯莖尖剝離生產(chǎn)無病毒植株生產(chǎn)脫毒薯苗應(yīng)用以來，世界各地紛紛采用馬鈴薯莖尖脫毒快繁技術(shù)。我國(guó)也于上世紀(jì)70年代初進(jìn)行了馬鈴薯莖尖組織培養(yǎng)，有效地防止了病毒感染和品種退化，提高了良種繁育的速度和產(chǎn)量。馬鈴薯無病毒苗的繁育及溫室移栽主要技術(shù)在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用，有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 脫毒苗的培養(yǎng)

1.1 馬鈴薯莖尖材料的處理

1.1.1 莖尖接種材料的選取 脫毒處理所用莖尖取自生長(zhǎng)活躍的芽，頂芽的莖尖成活率最高。馬鈴薯莖尖培養(yǎng)脫毒的效果與莖尖大小直接相關(guān)，莖尖附近的病毒濃度呈遞減分布，莖尖越小脫毒效果越理想。由于莖尖越小成活率越低，莖尖大小及芽的選擇就尤為重要，一般取帶1～2個(gè)葉原基的莖尖約0.1～0.5 mm[2-4]。葉原基提供莖尖生長(zhǎng)和發(fā)育的內(nèi)源生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素。尤其應(yīng)注重莖尖大小，一般按0.2～0.5 mm長(zhǎng)度切取，易脫毒、也易成活，既保證了一定的成活率，又能排除大多數(shù)病毒。

1.1.2 莖尖接種材料的消毒 莖尖接種材料的常見消毒方法有3種（表1）。一般情況下，剪取含葉原基的馬鈴薯莖尖芽條1～1.5 cm，采用常規(guī)消毒法既能達(dá)到消毒的目的。如果莖尖材料脫毒前能夠結(jié)合化學(xué)、物理熱處理、光照等效果更佳。

表1 徑尖接種材料的消毒方法

1.1.3 莖尖的接種 將經(jīng)消毒處理的莖尖材料置于體視鏡的承物臺(tái)上，在40倍的目鏡下左手拿鑷子夾住莖尖材料，右手用解剖針由外向里逐層將莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)的小葉片和葉原基剝離掉，最后只保留帶1～2個(gè)葉原基的生長(zhǎng)點(diǎn)，大小約為0.2～0.3 mm。

莖尖剝離后，用解剖針“切”下生長(zhǎng)點(diǎn)接種于經(jīng)高壓滅菌的培養(yǎng)基上，封嚴(yán)瓶口放于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 莖尖培養(yǎng)

1.2.1 培養(yǎng)基 馬鈴薯莖尖培養(yǎng)以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，并添加其它植物激素，以提高成苗率，縮短試管苗生長(zhǎng)周期。實(shí)踐證明，6-芐基腺嘌呤（6-BA）、赤霉素（GA3）和萘乙酸（NAA）是馬鈴薯試管苗快繁中使用較多的植物激素。6-BA是誘導(dǎo)莖尖產(chǎn)生叢生芽的主要物質(zhì)；GA3能顯著促進(jìn)試管苗株長(zhǎng)高，特別是生長(zhǎng)矮小的試管苗對(duì)培養(yǎng)基中GA3濃度有明顯反應(yīng)；NAA除能增加試管苗高度外，還能延長(zhǎng)試管苗各節(jié)節(jié)間長(zhǎng)度和增加切段繁殖的可用節(jié)數(shù)。

羅玉等[2]在MS的基礎(chǔ)上，添加0.1 mg/L GA3、0.1 mg/L NAA和0.05 mg/L 6-BA時(shí)，成苗較多，都有愈傷組織化的情況；林叢發(fā)等[3]則在MS的基礎(chǔ)上，添加0.05 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA、0.1 mg/L GA3和3%蔗糖，pH值5.8；而崔根芳等[5]研究認(rèn)為采用2倍MS液體培養(yǎng)基，添加0.1 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA、0.3 mg/L生長(zhǎng)延緩劑B9、0.3%的活性炭和2.5%蔗糖，不僅能縮短試管苗生長(zhǎng)周期，加快繁殖速度，提高移栽成活率，而且還可降低成本，比常規(guī)固體培養(yǎng)省時(shí)2/3，相對(duì)節(jié)電50%，省工40%，降低培養(yǎng)基成本30%，植株在液培中能充分得到熱、氣、水、養(yǎng)的協(xié)調(diào)供應(yīng)，生長(zhǎng)快而健壯。

1.2.2 培養(yǎng)條件 莖尖培養(yǎng)條件是：溫度23～25℃；光照強(qiáng)度2 000～4 000 lx；光照時(shí)間為12～16 h/d左右。若高于26℃易產(chǎn)生頂部燒苗現(xiàn)象，33℃以上，則瓶苗停止生長(zhǎng)[3]。在正常條件下，經(jīng)過30～40 d的培養(yǎng)，可見到莖尖有明顯的增長(zhǎng)。大約3～4個(gè)月后就能長(zhǎng)成小植株。

1.3 病毒檢測(cè)

病毒檢測(cè)的目的，是鑒定所獲得的試管苗是否完全脫除所有病毒。病毒檢測(cè)方法有兩種：一種是生物學(xué)方法，一種是血清學(xué)方法。目前血清學(xué)方法應(yīng)用普遍的是“酶聯(lián)免疫法（ELISA）[6]”。

1.4 脫毒試管苗繼代擴(kuò)繁

經(jīng)病毒檢測(cè)獲得不帶任何病毒的試管苗后，首先在三角瓶或罐頭瓶?jī)?nèi)進(jìn)行擴(kuò)繁。試管苗快速擴(kuò)繁是脫毒馬鈴薯種薯繁殖的第一步。通過繼代擴(kuò)繁使試管苗達(dá)到一定的基數(shù)是提高脫毒種薯生產(chǎn)量的關(guān)鍵，只有繁殖出足夠的試管苗，才能保證繁殖出足夠的脫毒微型薯。脫毒苗繼代擴(kuò)繁是在無菌條件下切取帶1～2個(gè)葉片和腋芽的節(jié)段接種于繼代培養(yǎng)基上，待其長(zhǎng)滿瓶后再切段接種繁殖。

1.4.1 繼代擴(kuò)繁培養(yǎng)基 試管苗快速繁殖，既可采用固體培養(yǎng)基，也可采用液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的成分是MS培養(yǎng)基，pH值5.6，不加有機(jī)物和植物激素。固體培養(yǎng)基中加入0.8%瓊脂（也可用魔芋粉），液體培養(yǎng)基則不加瓊脂。

1.4.2 莖節(jié)切段繁殖方法 莖節(jié)切段繁殖，是在無菌條件下將保存的基礎(chǔ)試管苗，按莖節(jié)切段接種于擴(kuò)繁培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。每個(gè)三角瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)5～7個(gè)獨(dú)立節(jié)段（罐頭瓶可培養(yǎng)15～20個(gè)），置于組培室普遍采用的多列多層組培架上立體培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度23～25℃，光照強(qiáng)度3 000 lx，光照時(shí)間16 h/d。培養(yǎng)20 d左右，脫毒苗達(dá)到5～7 cm、莖粗0.6～0.8 mm、葉片5～8片時(shí)就可移栽。

1.4.3 壯苗培育 為了提高馬鈴薯脫毒試管苗的移栽成活率，通過繼代擴(kuò)繁不僅要培育繁殖出足夠數(shù)量的試管苗，而且更應(yīng)培育壯苗。其措施一是充分利用太陽(yáng)散射光[8]；二是在培養(yǎng)基中提高鉀離子的濃度；三是添加合適濃度的生長(zhǎng)延緩劑B9。王巧玲等[7]研究認(rèn)為,當(dāng)加入140～155 mg/L KH2PO4、10～20 mg/L B9時(shí)，培育的試管苗高度合適、粗壯、葉片大、好移栽，成活率達(dá)100%；趙克蓉[8]在MS培養(yǎng)基中添加30 mg/L B9和500 mg/L的矮壯素（CCC）來控制試管苗徒長(zhǎng)，達(dá)到增加莖粗，縮短節(jié)間長(zhǎng)度，增強(qiáng)試管苗長(zhǎng)勢(shì)的目的。

2 馬鈴薯脫毒苗的溫室移栽

2.1 脫毒苗煉苗

脫毒馬鈴薯試管苗是在無菌、有營(yíng)養(yǎng)供給、適宜光照、溫度和100%的相對(duì)濕度環(huán)境中生長(zhǎng)的，并有適宜的生長(zhǎng)激素調(diào)節(jié)其生長(zhǎng)代謝。一旦試管苗從試管內(nèi)移到試管外，環(huán)境條件發(fā)生了變化，由異養(yǎng)變?yōu)樽责B(yǎng)，由無菌變?yōu)橛芯?，由恒溫、高濕、弱光向自然變溫、低濕、?qiáng)光過渡，葉片的光合能力、氣孔的適應(yīng)能力和根的主動(dòng)吸收能力需要逐漸發(fā)展，葉片表面的角質(zhì)層需要逐漸形成。因此，通過光培煉苗，盡可能使試管苗適應(yīng)外界生存的環(huán)境，以提高移栽成活率。脫毒馬鈴薯試管苗移栽前，首先打開瓶口，逐漸降低濕度，增強(qiáng)自然光光照，通過馴化，新葉逐漸形成蠟質(zhì)，產(chǎn)生表皮毛，降低氣孔開度，逐漸恢復(fù)氣孔功能，減少水分散失，促進(jìn)新根發(fā)生，以適應(yīng)環(huán)境。一般情況下初始光線應(yīng)為日光的1/10，其后每3 d增加10%，逐漸達(dá)到7 000～10 000 lx，中午適當(dāng)遮蔭；濕度按開始3 d為飽和濕度，其后每2～3 d降低5%～10%，直到與大氣相同。經(jīng)過7～10 d左右的煉苗后，脫毒馬鈴薯試管苗就可進(jìn)行移栽了。

2.2 苗床的準(zhǔn)備

2.2.1 苗床的配制 移栽脫毒苗的苗床介質(zhì)關(guān)鍵是疏松通氣，適宜的保水性，而且不易滋生雜菌。一般選用粗粒狀蛭石、粗沙、爐灰渣、鋸木屑等，或?qū)⑺鼈円砸欢ǖ谋壤旌鲜褂??；蛟谒芰洗笈锏葴厥覂?nèi)南北向用干凈的河沙或蛭石配制苗床，最好采用蛭石，或蛭石和珍珠巖按1∶1的配比，并用水和好（手握成團(tuán)但不淌水），鋪在溫室床內(nèi)，厚度3～5 cm，刮平后消毒待栽。

2.2.2 苗床的消毒 消毒時(shí)用代森錳鋅750～800倍液，或敵克松800～900倍液，或多菌靈1 000倍液，或百菌清600～800倍液，或1%福爾馬林溶液任選一種。苗床消毒5 d后即可進(jìn)行移栽。

2.3 脫毒苗移栽及管理

經(jīng)過5～7 d的光培煉苗后，試管苗就可由瓶?jī)?nèi)移栽到苗床上。移栽前浸濕或澆濕苗床基質(zhì)，移栽時(shí)一定要避開中午的強(qiáng)光，或采取遮陽(yáng)網(wǎng)遮蔭措施，降低光強(qiáng)。

移栽時(shí)采用開淺溝栽苗，按行距4～5 cm，株距3 cm左右開深1～2 cm的淺溝，把用15℃（35～40℃）的清水洗凈根部液體（固體）培養(yǎng)基的幼苗栽入，大苗宜深，小苗宜淺，栽后輕輕擠壓苗基部，并用噴（灑）壺適時(shí)適量噴（灑）水，使苗根部與基質(zhì)接觸，但不可出現(xiàn)積水現(xiàn)象。然后在其上部用塑料薄膜搭一高20～30 cm的小拱棚。

試管苗移栽后，根據(jù)溫室內(nèi)溫度和光照強(qiáng)度適當(dāng)遮蔭，控制光溫條件。溫度：馬鈴薯喜冷涼，不耐高溫，塊莖形成和膨大的最適宜溫度為16～18℃，晝夜溫差大對(duì)塊莖形成和膨大有利，溫度過高，蒸騰作用加強(qiáng)，并易滋生細(xì)菌類，同時(shí)，溫度不宜過低，否則幼苗生長(zhǎng)遲緩或不易成活。濕度：拱棚內(nèi)前5 d保證苗床90%以上的濕度，7 d后在小拱棚上逐漸增加開孔數(shù)，降低濕度，15 d后去掉小拱棚。光強(qiáng)：自然光周期下3 000～10 000 lx。脫毒苗成活后，根據(jù)苗情每隔1～2 d噴澆1次小水，苗弱時(shí)可噴施0.5%～1.0%的尿素或0.2%的磷酸二氫鉀等營(yíng)養(yǎng)液，10～15 d一次，苗徒長(zhǎng)時(shí)噴施多效唑或矮壯素。

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