李 延田 偉馬中龍

（1黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱和平路24號(hào)，150040；2黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)；3中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)開(kāi)發(fā)研究中心）

加味血府逐瘀湯抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究

李 延1田 偉2馬中龍3

（1黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱和平路24號(hào)，150040；2黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)；3中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)開(kāi)發(fā)研究中心）

目的：研究加味血府逐瘀湯對(duì)小鼠腹水型H22移植性腫瘤模型的抗腫瘤作用和對(duì)VEGF的影響。方法：昆明種雄性小鼠100只，接種H22肝癌細(xì)胞，建立小鼠腹水型H22移植性腫瘤模型，隨機(jī)分為10組，分別給予生理鹽水、卡培他濱、加味血府逐瘀湯（高、中、低劑量）灌胃，連續(xù)10天，第11天處死，觀察抑瘤率、生命延長(zhǎng)率的變化；用免疫組化方法檢測(cè)VEGF在腫瘤中的表達(dá)，SPSS13.0軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：卡培他濱、加味血府逐瘀湯（高、中、低劑量）組的抑瘤率分別為60%、49%、41%、35%，生命延長(zhǎng)率分別為1.68%、157.98%、70.58%、49.57%。結(jié)論：加味血府逐瘀湯能明顯抑制荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞增殖，明顯延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存時(shí)間，降低腫瘤組織和瘤周組織中的VEGF表達(dá)。

加味血府逐瘀湯；H22小鼠模型；抑瘤率；生命延長(zhǎng)率

原發(fā)性肝癌（HCC）是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，由于起病隱匿，確診時(shí)多已屬中晚期，治療效果差，預(yù)后惡劣，嚴(yán)重威脅人們的生命與健康。故研發(fā)安全有效的治療HCC的藥物和方法，是國(guó)內(nèi)外廣大醫(yī)務(wù)工作者的重要課題。我們研究了加味血府逐瘀湯對(duì)小鼠腹水型H22移植性腫瘤模型的抗腫瘤作用和對(duì)VEGF的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種清潔級(jí)小鼠100只，雄性，體重18～22g，6～8周齡。購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，置于溫度20℃左右，濕度63%左右，室內(nèi)，以普通小鼠飼料喂養(yǎng)。

1.2 肝癌瘤株 小鼠H22腹水型肝癌瘤株，購(gòu)自黑龍江腫瘤病防治研究所，清潔級(jí)昆明種小鼠傳代。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 加味血府逐瘀湯：由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥廠制備，每毫升含生藥1g。然后根據(jù)所需濃度再加以濃縮?？ㄅ嗨麨I（希羅達(dá)）：購(gòu)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，上海羅氏制藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20073024。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 醫(yī)用凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠），電子分析天平（沈陽(yáng)龍騰電子有限公司），超低溫冰箱（日本三洋公司），光學(xué)顯微鏡（日本Olympus光學(xué)儀器公司），CAPP微量加樣器（丹麥產(chǎn)200μL、10μL）。

1.5 實(shí)驗(yàn)制劑 無(wú)水乙醇、二甲苯、蘇木素液、雙氧水溶液、氫氧化鈉溶液等試劑均購(gòu)自哈爾濱萬(wàn)騰醫(yī)療器械化學(xué)試劑批發(fā)站。小鼠VEGF抗體，辣根標(biāo)記抗兔PV-6011（二抗）、辣根標(biāo)記抗小鼠PV-6002（二抗）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.6 實(shí)驗(yàn)方法 建立小鼠H22腫瘤模型，造模24h后，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將50只模型小鼠隨機(jī)分成5組，每組10只。灌胃給藥10天，每日1次。模型組（A組）：給予0.9%NaCl 0.4mL/20g，陽(yáng)性對(duì)照組（B組）：給予希羅達(dá)375mg/kg，0.4mL/20g，JW低、中、高劑量組（C、D、E組）：分別給予加味血府逐瘀湯12.5g/kg、25g/kg、50g/kg，0.4mL/20g。將其余50只模型小鼠根據(jù)體重分層隨機(jī)分為5組，每組10只，組別和給藥劑量同前。每日灌胃給藥，連續(xù)10天后，改為每3天給藥1次。

1.7 檢測(cè)指標(biāo) 抑瘤率：末次給藥24h后，稱小鼠體重，用脊髓脫臼法處死小鼠，右上肢腋下皮膚常規(guī)消毒，剝離腋窩處瘤體，分析天平稱取瘤重，計(jì)算抑瘤率。生命延長(zhǎng)率：給藥10天后開(kāi)始記錄各組動(dòng)物死亡時(shí)間（以天為單位計(jì)算）。結(jié)果用平均存活天數(shù)和生命延長(zhǎng)率表示。VEGF：制作病理切片，用免疫組化方法檢測(cè)VEGF。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：每組隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野（×400），計(jì)數(shù)1000個(gè)癌細(xì)胞，計(jì)算出陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比。VEGF陽(yáng)性表達(dá)為腫瘤細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。計(jì)算結(jié)果后用數(shù)碼相機(jī)照相。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)使用SPSS13.0軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 抑瘤率 將腫瘤取出后，稱取瘤重，計(jì)算平均瘤重及抑瘤率。結(jié)果顯示，生理鹽水組腫瘤明顯重于其他4組，抑瘤率以西藥組最高，加味血府逐瘀湯各劑量組也有明顯的抑瘤作用，其結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加味血府逐瘀湯對(duì)H22荷瘤小鼠的抑瘤作用

2.2 對(duì)生命延長(zhǎng)率的影響 加味血府逐瘀湯能明顯延長(zhǎng)H22肝癌荷瘤小鼠的生存時(shí)間，與模型組和陽(yáng)性對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 對(duì)H22肝癌荷瘤小鼠生命延長(zhǎng)率的影響

2.3 免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 A組VEGF表達(dá)明顯高于其他4組，組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05），加味血府逐瘀湯中、高劑量組與希羅達(dá)組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。具體結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

原發(fā)性肝癌（HCC）是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢(shì)，目前仍以手術(shù)治療為主，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高，5年生存率較低，且多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)失去了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，其他治療手段也不甚理想。近年來(lái)中醫(yī)藥治療腫瘤越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外同仁的關(guān)注和認(rèn)同，我們將血府逐瘀湯加入山慈菇、人參、蜈蚣，組成加味血府逐瘀湯，對(duì)H22肝癌荷瘤小鼠進(jìn)行了抗腫瘤作用的研究。

表3 對(duì)H22肝癌腹水瘤荷瘤鼠VEGF表達(dá)率的影響

本課題研究結(jié)果顯示加味血府逐瘀湯能明顯抑制H22肝癌荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，低、中、高劑量組的抑瘤率分別為35%、41%、49%，雖然作用弱于卡培他濱組（60%），但本實(shí)驗(yàn)顯示加味血府逐瘀湯的抑瘤作用與劑量呈正相關(guān)，如果加大劑量，其作用還會(huì)有所增強(qiáng)，我們將進(jìn)一步研究。

評(píng)價(jià)一個(gè)抗腫瘤藥物的優(yōu)劣，最主要的是看其療效和對(duì)生活質(zhì)量的影響，療效中應(yīng)以生存時(shí)間為首位。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示加味血府逐瘀湯低、中、高劑量組對(duì)H22肝癌荷瘤小鼠的生命延長(zhǎng)率分別為49.57%、70.58%、157.98%，與陽(yáng)性對(duì)照組（卡培他濱組為1.68%）比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說(shuō)明加味血府逐瘀湯能明顯延長(zhǎng)H22肝癌荷瘤小鼠的生存時(shí)間。結(jié)果表明加味血府逐瘀湯組對(duì)荷瘤小鼠體重?zé)o明顯影響，且精神狀態(tài)較模型組和陽(yáng)性對(duì)照組均佳。

VEGF（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）是促進(jìn)血管新生最重要的生長(zhǎng)因子，是現(xiàn)今為止所知的作用最強(qiáng)的促血管生成因子，可促進(jìn)血管內(nèi)皮增殖、遷移，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡通路，阻礙內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過(guò)程，它是一種選擇性促內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，通過(guò)與VEGF受體結(jié)合，增加血管通透能力，引起一系列信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移具有重要的意義。VEGF可促進(jìn)血管內(nèi)皮分裂，促進(jìn)血管新生，增加血管通透性，促進(jìn)血漿纖維蛋白的外滲，產(chǎn)生纖維網(wǎng)格，有利于毛細(xì)血管網(wǎng)及腫瘤間質(zhì)的形成［1］。肝癌的血管生成對(duì)于肝癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移具有重要的作用［2-3］。有研究表明，實(shí)體瘤達(dá)到2～3mm3時(shí)，如果沒(méi)有新的血管生成，腫瘤將不再生長(zhǎng)且不會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移，一直處于“冬眠狀態(tài)”［4］。肝癌是典型的多血管腫瘤，因而抗血管治療是一種最有希望的治療方法。因此，通過(guò)觀察藥物對(duì)瘤體中VEGF的表達(dá)的影響可以探討其作用機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示A組VEGF表達(dá)明顯高于其他4組，組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05），加味血府逐瘀湯中、高劑量組與希羅達(dá)組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究結(jié)果表明：加味血府逐瘀湯能明顯抑制H22肝癌荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)其生存期，對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子具有抑制作用，值得進(jìn)一步研究。

［1］Inoshima N，Nakanishi Y，Minami T，et al.The influence of dendritic cell infiltration and vascular endothelial growth factor expression on the prognosis of non-small cell lung cancer.Clin Cancer Res，2002，8（11）：3480-3486.

［2］Folkman J.Role of angiogenesis in tumor growth and metastasis.Semin Oncol，2002，29（6 Suppl 16）：15-18.

［3］Cha C，Dematteo RP.Molecular mechanisms in hepatocellular carcinoma development.Best Pract Res Clin Gastroenterol，2005，19：25-37.

［4］N.Ferrara，VEGF and the quest for tumour angiogenesis factors. Nat.Rev.Cancer，2002，2：795-803.

（2010-06-06收稿）

Anti-tumor Effect of Modified Xuefu Zhuyu Decoction

Li Yan1，Tian Wei2，Ma Zhonglong3
（1.First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Add.：No.24，Heping Road，Haerbin，Heilongjiang Province，Post code：150040；2.Heilongjiang University of Chinese Medicine；3.Traditional Chinese Medicine Research and Development Center）

Objective：To investigate anti-tumor effect of Modified Xuefu Zhuyu Decoction and its impact on VEGF.Methods：Adult male mice（n=100），inoculated with H22hepatoma cells，were randomized to 10 groups and administered saline，capecitabine，Modified Xuefu Zhuyu Decoction（high，medium and low dose）.Tumor inhibition rate，life extension rate and the expression of VEGF in tumors were detected on Day11.Results：Tumor inhibition rate of Capecitabine and Modified Xuefu Zhuyu Decoction at high，medium and low dose were 60%，49%，41%，35%，life extension rate：1.68%157.98%，70.58%，49.57%.Conclusion：Modified Xuefu Zhuyu Decoction can inhibit tumor cell proliferation in tumor bearing mice，significantly prolong the survival time of mice，and reduce expression of VEGF in the tumor tissue.

Modified Xuefu Zhuyu Decoction；H22mice model；Inhibition rate of tumor；Life extension rate