張艷玲 張艷英 岳偉華

（1北京大學(xué)精神衛(wèi)生研究所，北京；2衛(wèi)生部精神衛(wèi)生學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100191；3北京航天總醫(yī)院，北京100076；4臨沂市精神衛(wèi)生中心，山東 臨沂276000）

亞甲基四氫葉酸還原酶（Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）基因 位于人類染色體1p36.3區(qū)［1］，既往研究表明染色體1p36區(qū)域與精神分裂癥存在較強(qiáng)連鎖［2］。該基因全長(zhǎng)約20kb，編碼656個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，包括11個(gè)外顯子。MTHFR基因編碼生成的亞甲基四氫葉酸還原酶是葉酸代謝體系中一個(gè)重要酶體系，在半胱氨酸代謝過程中發(fā)揮非常重要的作用，可催化N5，N10亞甲基四氫葉酸還原成N5甲基四氫葉酸，而后者再將甲基轉(zhuǎn)給同型半胱氨酸（hcy）使其生成甲硫氨酸（met）。研究發(fā)現(xiàn)MTHFR基因有多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中常見的是C677T、A1298C兩種多態(tài)性。Frosst等發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T突變使氨基酸發(fā)生錯(cuò)譯，纈氨酸代替丙氨酸，導(dǎo)致不耐熱MTHFR活性下降［3－4］。研究結(jié)果顯示TT型突變對(duì)酶的活性影響最大，TT型突變酶的活性在37℃時(shí)為CC型酶活性的40%～50%，雜合子突變酶活性的下降程度居CC型與TT型之間［5］。MTHFR酶活性降低，導(dǎo)致同型半胱氨酸復(fù)甲基化生成甲硫氨酸過程發(fā)生障礙，引起高同型半胱氨酸血癥，進(jìn)而誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死和新生兒出生缺陷等疾病的發(fā)生。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)MTHFR基因C677T多態(tài)性與精神分裂癥的關(guān)聯(lián)研究結(jié)果存在較大分歧。部分研究表明MTHFR C677T是精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)［6］，而也有部分研究不能驗(yàn)證這種關(guān)聯(lián)［7－8］。但所有meta分析結(jié)果均顯示MTHFR C677T多態(tài)性與精神分裂癥顯著關(guān)聯(lián)［9－13］。本研究前期采用兩階段研究設(shè)計(jì)，在中國(guó)漢族人群中進(jìn)行精神分裂癥的全基因組關(guān)聯(lián)研究，第一階段運(yùn)用Illumina HumanHap610單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）芯片，對(duì)746例精神分裂癥患者和1599例健康對(duì)照的620901個(gè)SNPs進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T多態(tài)性與精神分裂癥顯著關(guān)聯(lián)；第二階段運(yùn)用Sequenom質(zhì)譜分型技術(shù)，在獨(dú)立的4027例精神分裂癥患者及5630例正常對(duì)照中進(jìn)行獨(dú)立驗(yàn)證，進(jìn)一步證實(shí)MTHFR C677T與精神分裂癥的關(guān)聯(lián)［14］。

已有研究表明遺傳因素對(duì)精神分裂癥患者的發(fā)病年齡有著重要的影響［15］。Vares等［16］于2010年采用生存分析的方法，研究MTHFR C677T基因多態(tài)性與精神分裂癥發(fā)病年齡之間的關(guān)系，結(jié)果表明精神分裂癥發(fā)病年齡與677T風(fēng)險(xiǎn)等位基因之間存在劑量依賴效應(yīng)，即攜帶T等位基因的個(gè)體比不攜帶T等位基因的個(gè)體患病年齡小，且呈劑量依賴效應(yīng)。本研究擬采用DNA測(cè)序檢測(cè)方法，結(jié)合臨床病例資料分析MTHFR C677T多態(tài)性與精神分裂癥發(fā)病年齡及臨床療效的關(guān)聯(lián)。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

病例為2003年至2011年間累積收集的住院診治的1130例漢族精神分裂癥患者，其中男性558例，女性572例，發(fā)病年齡（23.3±6.8）歲。均為偏執(zhí)型精神分裂癥，依據(jù)《美國(guó)精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)—第4版（DSM－IV）》精神分裂癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)，由兩名以上精神科醫(yī)師（其中至少1名是主治醫(yī)師）獨(dú)立診斷，診斷一致并排除其他精神科疾病。所有研究對(duì)象均無嚴(yán)重軀體疾病。

1130例精神分裂癥患者中，306例接受單一種類抗精神病藥治療8周，其中，利培酮（2～6mg／d）181例、奧氮平（5～20mg／d）89例、喹硫平（400～750mg／d）36例。采用簡(jiǎn)明精神癥狀評(píng)定量表（Brief psychiatric rating scale，BPRS）評(píng)估精神分裂癥患者的臨床癥狀，并以BPRS減分率［（基線總分－療后總分）／（基線總分－30）×100%］作為抗精神病藥主要療效的評(píng)價(jià)工具。參加BPRS量表評(píng)定的精神科醫(yī)師于研究開始前接受培訓(xùn)，兩醫(yī)師評(píng)定一致性Kappa值＞0.85，量表評(píng)定在患者入院后一周內(nèi)完成。

所有研究對(duì)象均來自中國(guó)北方地區(qū)漢族人群，均于入組前詳細(xì)了解本研究的目的和程序，由患者本人或其法定監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。本研究已獲得北京大學(xué)第六醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

所有受試者抽取外周靜脈血5～10ml，置于抗凝管中，于4℃保存，1周內(nèi)采用QIAGEN公司的全血提取試劑盒提取基因組DNA，并分裝凍存待測(cè)。

25μl的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：10mM Tris－HCl（pH 8.3），50mM氯化鉀，1.5mM氯化鎂，200μM dNTPs，0.4μM引物，30～50ng基因組DNA，1單位Taq DNA聚合酶。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55～59℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃后延伸10min。取20μl的PCR產(chǎn)物經(jīng)PE Biosystem公司生產(chǎn)的含AmpliTaq DNA聚合酶熒光標(biāo)記測(cè)序試劑盒純化，內(nèi)引物擴(kuò)增，進(jìn)行循環(huán)測(cè)序反應(yīng)，產(chǎn)物片斷的分離在ABI PRISM 377－96DNA自動(dòng)測(cè)序儀（Applied Biosystem）上完成DNA測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用社會(huì)科學(xué)統(tǒng)計(jì)分析軟件包（Statistical Packages for Social Science 16.0，SPSS 16.0）進(jìn)行一般臨床資料與基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)統(tǒng)計(jì)分析。采用ANOVA方差分析及生存分析（Kaplan－Meier survival curves）進(jìn)行MTHFR C677T基因多態(tài)性與發(fā)病年齡的關(guān)聯(lián)研究；采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行MTHFR C677T基因多態(tài)性與BPRS減分率的關(guān)聯(lián)研究。雙側(cè)P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

2 結(jié)果

2.1 精神分裂癥患者發(fā)病年齡的性別差異

本研究通過采集病史，共獲得1130例精神分裂癥患者的發(fā)病年齡信息，其中，男性患者558例，女性患者572例。考慮到性別因素在精神分裂癥發(fā)病中的影響，將1130例精神分裂癥患者按性別分為兩組，并進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)男性患者發(fā)病年齡早于女性（P＝0.004）（見表1及圖1A）。

表1 性別與精神分裂癥發(fā)病年齡的關(guān)聯(lián)研究

2.2 MTHFR基因C677T多態(tài)性與精神分裂癥發(fā)病年齡的關(guān)聯(lián)

并將1130例精神分裂癥患者依據(jù)MTHFR基因C677T多態(tài)性的基因型分為CC、CT、TT三組，進(jìn)一步比較不同基因型攜帶者的發(fā)病年齡有無差異。ANOVA方差分析結(jié)果顯示，三組基因型攜帶者之間精神分裂癥發(fā)病年齡差異有統(tǒng)計(jì)顯著性（P＝0.039）（見表2）。進(jìn)一步進(jìn)行Post Hoc檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TT基因型攜帶者的發(fā)病年齡較CC攜帶者的發(fā)病年齡小（P＝0.012）。

表2 MTHFR基因C677T多態(tài)性與全部及不同性別組精神分裂癥患者發(fā)病年齡的關(guān)聯(lián)分析

為了更清晰的顯示MTHFR基因C677T多態(tài)性對(duì)精神分裂癥發(fā)病年齡的影響，我們采用生存分析的方法做了進(jìn)一步的研究。結(jié)果如圖1B所示，18歲之前三種基因型間發(fā)病情況無差異，即T風(fēng)險(xiǎn)等位基因在18歲之前對(duì)疾病的發(fā)病年齡沒有影響或者影響很小。18歲之后T風(fēng)險(xiǎn)等位基因?qū)膊“l(fā)病年齡的影響呈現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)基因型劑量依賴效應(yīng)。即攜帶T風(fēng)險(xiǎn)等位基因的患者發(fā)病要早于攜帶C等位基因的患者。

為此，我們分別在男性患者和女性患者中進(jìn)一步進(jìn)行方差分析及生存分析。結(jié)果顯示在男性精神分裂癥患者中MTHFR C677T基因多態(tài)性與發(fā)病年齡并無顯著關(guān)聯(lián)（P＝0.741；Plog rank＝0.639）（見圖1C及表2），而在女性患者中該基因多態(tài)性則與發(fā)病年齡顯著關(guān)聯(lián)（P＝0.013；Plog rank＝0.023）（見圖1D及表2）。

圖1 MTHFR基因C677T多態(tài)性與精神分裂癥發(fā)病年齡的生存分析

2.3 MTHFR基因C677T多態(tài)性與精神病藥物療效（BPRS減分率）的關(guān)聯(lián)

為了進(jìn)一步探索MTHFR基因C677T多態(tài)性是否會(huì)對(duì)抗精神病藥物的臨床療效產(chǎn)生影響，本研究結(jié)合臨床資料（抗精神病藥用藥信息以及療效評(píng)估BPRS量表評(píng)估等）做進(jìn)一步的分析。研究結(jié)果表明MTHFR C677T基因多態(tài)性與精神分裂癥抗精神病藥物療效（BPRS減分率）之間并無顯著關(guān)聯(lián)（見表3）。

表3 MTHFR基因C677T多態(tài)性與抗精神病藥物療效（BPRS減分率）的關(guān)聯(lián)

3 討論

本研究基于課題組前期精神分裂癥GWAS的發(fā)現(xiàn)－MTHFR基因C677T多態(tài)性與精神分裂癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著關(guān)聯(lián)［15］，結(jié)合臨床病例資料分析MTHFR C677T多態(tài)性與精神分裂癥發(fā)病年齡的關(guān)聯(lián)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T三種基因型三組間精神分裂癥發(fā)病年齡有顯著性差異（P＝0.039），TT基因型攜帶者的發(fā)病年齡較CC攜帶者的發(fā)病年齡?。≒＝0.012）。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示男性患者發(fā)病年齡早于女性（P＝0.004），而且發(fā)現(xiàn)該基因多態(tài)性對(duì)發(fā)病年齡的影響主要體現(xiàn)在女性患者中（P＝0.013；Plog rank＝0.023），對(duì)男性患者的發(fā)病年齡并無明顯影響。Vares等［16］采用生存分析的方法，研究MTHFR C677T基因多態(tài)性對(duì)精神分裂癥發(fā)病年齡的影響，結(jié)果表明677T風(fēng)險(xiǎn)等位基因?qū)穹至寻Y發(fā)病年齡有顯著的影響，并且發(fā)病年齡與677T風(fēng)險(xiǎn)等位基因之間存在劑量依賴效應(yīng)，即攜帶T等位基因的個(gè)體比不攜帶T等位基因的個(gè)體患病年齡小。本研究與上述Vares等的研究結(jié)果相似，同樣發(fā)現(xiàn)了該風(fēng)險(xiǎn)等位基因?qū)穹至寻Y發(fā)病年齡有顯著的影響，但本研究通過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)該基因多態(tài)性對(duì)發(fā)病年齡的影響主要體現(xiàn)在女性患者中，對(duì)男性患者的發(fā)病年齡并無顯著影響。提示在不同人群中均可能存在MTHFR基因多態(tài)性與精神分裂癥發(fā)病年齡的關(guān)聯(lián)，但可能受性別因素的影響。

另外本研究發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T基因多態(tài)性與精神分裂癥抗精神病藥物療效（BPRS減分率）之間并無顯著關(guān)聯(lián)。我們認(rèn)為可能是目前的樣本量不夠大，統(tǒng)計(jì)效能尚達(dá)不到要求，不足以發(fā)現(xiàn)該基因多態(tài)性與精神分裂癥抗精神病藥物療效之間的關(guān)聯(lián)，需要在較大的樣本中重復(fù)該基因多態(tài)性與精神分裂癥抗精神病藥物療效之間的遺傳關(guān)聯(lián)研究。

本研究提示MTHFR C677T多態(tài)性對(duì)精神分裂癥發(fā)病年齡有顯著影響，提示該基因多態(tài)性在精神分裂癥的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要的作用，但藥物遺傳研究仍需進(jìn)一步深入探索。

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