朱繼紅，孫滿吉，張永根

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

瘤胃作為一個(gè)龐大的微生物資源庫，存在著大量的細(xì)菌、真菌及原蟲，還有少量的噬菌體。經(jīng)過長期的適應(yīng)和選擇，微生物和宿主之間、微生物與微生物之間處于一種相互依賴、相互制約的動(dòng)態(tài)平衡系統(tǒng)中。瘤胃中50%的纖維素消化，宏觀認(rèn)為是瘤胃細(xì)菌、真菌和原蟲共同作用的結(jié)果，而在這一消化過程中，80%由細(xì)菌完成，主要是由于細(xì)菌數(shù)量及代謝產(chǎn)物多樣性的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)[1-2]。外國對(duì)瘤胃細(xì)菌及真菌的分離已經(jīng)取得較多成果，目前已經(jīng)分離出200多個(gè)微生物種類[3]。我國關(guān)于瘤胃微生物分離的研究較少，目前報(bào)道的僅有張曉華從瘤胃內(nèi)容物中分離得到1株瘤胃梭菌，彭海宏分離得到1株真菌，劉玉承在瘤胃內(nèi)容物中分離出7株濾紙降解能力顯著的細(xì)菌，王平篩選出1株產(chǎn)纖維素酶活較高的米曲霉菌[3-6]。瘤胃微生物的研究已成為反芻動(dòng)物研究的重點(diǎn)之一，本試驗(yàn)以稻草秸稈為唯一碳源，選擇對(duì)稻草秸稈利用效果較好的菌株，通過測(cè)定菌株的纖維素酶活及對(duì)稻草秸稈的降解率，擬篩選一株瘤胃纖維降解菌。

1 試驗(yàn)材料

1.1 瘤胃液的采集

選用裝有永久性瘺管的健康瘺管牛，自由飲水，在正常采食后，使用自制負(fù)壓取樣器于瘤胃內(nèi)不同部位采集瘤胃液，過濾，通入CO2，于37℃保存迅速送回實(shí)驗(yàn)室，備用。

1.2 稻草秸稈

稻草秸稈為收獲水稻后的優(yōu)質(zhì)，無霉變的稻草秸稈，烘干后粉碎（40～60目），備用。

1.3 培養(yǎng)基

選擇性初篩固體培養(yǎng)基：KH2PO41.00 g、Mg?SO40.3 g、NaCl 0.1 g、NaNO32.5 g、CaCl2·6H2O 0.1 g、FeCl30.01 g、稻草粉20 g、pH自然；CMC-Na分離培養(yǎng)基：CMC-Na 20 g、Na2HPO42.5 g、KH2PO41.5 g、蛋白胨2.5 g、瓊脂20 g、pH 7.0～7.5；纖維素-剛果紅鑒別培養(yǎng)基[7]：（NH4）2SO42.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、 K2HPO4l.0 g、 NaCl 0.5 g、 CMC-Na 2.0 g、剛果紅0.4 g、瓊脂20 g、pH 7.0；種子培養(yǎng)基（PDA）：可溶性淀粉6 g，葡萄糖20 g，酵母粉2 g，蛋白胨 5 g，KH2PO42 g，MgSO40.3 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL；固體發(fā)酵培養(yǎng)基：稻草秸稈粉、玉米粉、豆粕粉、麩皮按比例混勻，固液比為1∶1.5。

1.4 主要儀器設(shè)備

生物凈化工作臺(tái)DL-CJ-ZND型，由北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司生產(chǎn)；全溫度恒溫度氣浴搖床HZQ-C型，由哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)；立式壓力蒸汽滅菌鍋YXQ-LS-30SI型，由南京萊布公司生產(chǎn)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌株初篩

在無菌狀態(tài)下取瘤胃液用生理鹽水進(jìn)行不同梯度的稀釋。選取其中的3個(gè)稀釋梯度各0.1 mL，涂布于選擇性初篩平板培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)，置于37℃CO2恒溫培養(yǎng)箱，連續(xù)培養(yǎng)24～48 h后，進(jìn)行觀察分離。

2.2 菌株純化

用無菌接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，用無菌生理鹽水稀釋，接種于CMC-Na分離培養(yǎng)基上，進(jìn)行單菌落培養(yǎng)，反復(fù)多次，直至平皿中菌落形態(tài)完全一致，鏡檢后，置于4℃冰箱保存。

2.3 菌株鑒別

將純化菌株用生理鹽水稀釋接種于剛果紅鑒別培養(yǎng)基上，置于37℃CO2恒溫培養(yǎng)箱，連續(xù)培養(yǎng)72 h，用1 moL·L-1NaCl溶液脫色20 min，在菌落周圍有透明圈產(chǎn)生證明該菌種產(chǎn)纖維素酶。用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量透明圈直徑和菌落直徑，根據(jù)透明圈直徑/相應(yīng)菌落直徑初步確定產(chǎn)纖維素酶較高的菌株。

2.4 固體發(fā)酵復(fù)篩

將混勻的固體發(fā)酵培養(yǎng)基定量地裝入500 mL的三角瓶中，高壓滅菌后冷卻，將種子培養(yǎng)基上生長良好的菌落用無菌生理鹽水沖洗制成孢子懸浮液，按10%的比例接種，混勻，置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)5 d，取樣測(cè)酶活。對(duì)照組加入10%的無菌生理鹽水。

2.5 纖維素酶活的測(cè)定

纖維素酶活的測(cè)定參照Bowman等方法[8]。本試驗(yàn)酶活性的測(cè)定方法為DNS法。

2.5.1 粗酶夜的制備

取固體發(fā)酵物4.0 g，加入生理鹽水46 mL浸泡2 h后，13000 rpm離心5 min，取上清液作為粗酶液。

2.5.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取于105℃烘干的無水葡萄糖1.00 g，配成濃度為1mg·mL-1的葡萄糖溶液，再分別配成濃度為0、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、0.8、0.9、1.0mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸取葡萄糖溶液1.0 mL于15 mL刻度試管中，然后加入DNS 2.0 mL溶液，混勻，用保鮮膜封口后，煮沸5 min，流水冷卻5 min，用蒸餾水定容至10 mL，混勻后在紫外分光光度計(jì)上于530 nm處比色，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，見附圖。

附圖 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5.3 羧甲基纖維素酶活性的測(cè)定

取15 mL的刻度試管4支，每支試管中加入1.0%羧甲基纖維素鈉1 mL，加入0.05 mol·L-1、pH 6.0磷酸鹽緩沖液1 mL。1號(hào)試管為酶樣空白，2、3、4號(hào)試管為酶樣平行樣。50℃水浴震蕩30 min，1號(hào)管加入磷酸鹽緩沖液0.5 mL，2、3、4號(hào)試管各加入酶液0.5 mL，50℃下水浴震蕩培養(yǎng)60 min（精確）。培養(yǎng)后4支試管立即加入DNS溶液2 mL，保鮮膜封口，渦旋混勻后在開水浴中煮沸5 min，取出后用循環(huán)水冷卻5 min，用蒸餾水定容至10 mL。以1號(hào)管為空白，在紫外分光光度計(jì)上于530 nm波長處進(jìn)行比色。

2.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0的ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 初篩結(jié)果

經(jīng)以稻草秸稈為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基初篩、分離得到19株菌，分別編號(hào)為R1～R19。經(jīng)纖維素剛果紅鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察不同菌株在培養(yǎng)基上的透明圈直徑/菌株直徑大小，篩選出7株產(chǎn)酶活性較好的菌株，瘤胃纖維降解菌初篩結(jié)果見表1。

表1 瘤胃纖維降解菌初篩結(jié)果

由表1可知，編號(hào)為R5、R3菌株產(chǎn)酶所形成的水解圈直徑（R）與菌落直徑（r）的比值較大，分別為6.64、6.27，表明該菌具有較高的產(chǎn)酶能力并且酶活力較強(qiáng)，并且具有較強(qiáng)的繁殖能力和分解羧甲基纖維素的能力。

3.2 復(fù)篩結(jié)果

將初篩出的7株菌用于固體發(fā)酵進(jìn)行復(fù)篩。在發(fā)酵5 d后，取發(fā)酵秸稈制備粗酶液測(cè)其羧甲基纖維素酶活和DM消失率，測(cè)定結(jié)果見表2。

由表2可知，無論是酶活大小還是DM消失率，R3均優(yōu)于其他6株菌。

表2 瘤胃纖維降解菌液體發(fā)酵結(jié)果

4 討論

4.1 纖維素降解菌的初篩

在平板降解圈分離纖維降解菌的諸多方法中，有的受底物來源的限制，有的靈敏度低，需培養(yǎng)較長時(shí)間，有的則因殺死菌體而需用影印移植，對(duì)分離工作造成諸多不便。而剛果紅法則無上述缺點(diǎn)，且對(duì)菌體無任何不良影響、靈敏度高、產(chǎn)生的透明圈清晰、易辨認(rèn)?；谝陨咸攸c(diǎn)，剛果紅法成為分離纖維降解菌最直觀、最快捷的方法。有研究者認(rèn)為，對(duì)數(shù)酶濃度同剛果紅染色水解圈存在線性關(guān)系，產(chǎn)酶越多，透明圈越大，產(chǎn)酶越快，透明圈出現(xiàn)越早。此法除可用于識(shí)別產(chǎn)纖維素酶的菌株，還可用于初步判定酶活性高低。本試驗(yàn)通過纖維素酶法篩選出可產(chǎn)纖維素酶的菌株19株，確定透明斑直徑/菌落直徑較大的7株菌作為復(fù)篩對(duì)象。然而，有研究認(rèn)為，透明圈的大小可以直接反映產(chǎn)酶濃度的高低，但不能完全代表菌株產(chǎn)酶能力。其原因主要為固體和液體培養(yǎng)基條件的不同；不同菌株的生長及產(chǎn)酶速度均不同；菌落大小及在平板上堆積情況的不同等都會(huì)造成透明圈大小不同，所以固體發(fā)酵復(fù)選必不可少。

4.2 纖維素酶活力的測(cè)定

纖維降解菌的性能大多用羧甲基纖維素酶來衡量。蔡燕飛等從自然界中篩選分離獲得具有高效分解纖維素功能的克雷伯氏菌、假單胞菌和嗜麥芽窄食單胞菌，假單胞菌屬不僅能分解纖維素，而且對(duì)二氯酚、阿特拉津等有機(jī)廢棄物有降解功效，克雷伯氏菌屬有固氮和分解纖維素功能，嗜麥芽窄食單胞菌對(duì)植物發(fā)現(xiàn)各單一菌株對(duì)纖維素類物質(zhì)均有一定的降解效果，其羧甲基纖維素CMC酶相對(duì)活性為0.93 cm·d-1[9]。本試驗(yàn)通過液體發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定發(fā)酵后液體的纖維素酶活及濾渣的DM消失率，發(fā)現(xiàn)待選的7株菌中，纖維素酶活度最高能達(dá)到5.94 U·g-1，相應(yīng)的DM消失率達(dá)到23.73%。中科院微生物菌種保藏中心的產(chǎn)纖維素酶專用菌株綠色木霉（trichodermasp）AS3·3711，在優(yōu)化的培養(yǎng)基上發(fā)酵，最高為7.0 U·g-1[10]。故可推測(cè)對(duì)菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，本試驗(yàn)分離的7株菌的酶活力還能有所提高。

5 結(jié)論

分離得到19株對(duì)纖維降解有作用的菌株，其中有7株降解作用顯著，分別為R2、R3、R4、R5、R7、R14、R19，綜合剛果紅染色、纖維素酶測(cè)定及DM消失率測(cè)定，最終以R3效果最佳，其透明斑直徑/菌落直徑為6.27、纖維素酶活為5.94 U·g-1、DM消失率達(dá)到23.73%。

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