范 媛，謝光武，黎曉敏

（1.重慶市萬州動物衛(wèi)生監(jiān)督所，重慶 404000；2.西南大學(xué)動物科技學(xué)院，重慶 400715）

免疫佐劑CpG-DNA的發(fā)現(xiàn)源于早期人們對癌癥治療的探究。研究已證實(shí)，CpG-DNA作為多種抗原的佐劑，表現(xiàn)出獨(dú)特的免疫增強(qiáng)作用，其可以刺激機(jī)體對免疫原產(chǎn)生較早、較強(qiáng)、較持久的免疫應(yīng)答。此外，CpG-DNA經(jīng)鼻腔、口腔、直腸等途徑免疫接種后，具有明顯的黏膜佐劑的效應(yīng)；而作為新型疫苗的佐劑，其能夠克服新型疫苗中PAMP不足的缺陷，通過模擬感染過程誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答[1]。然而，CpG-DNA的體內(nèi)清除和有效遞呈卻在很大程度上限制了其免疫學(xué)應(yīng)用。特別是APCs細(xì)胞對CpG-DNA的結(jié)合與攝取是誘發(fā)免疫應(yīng)答的首要環(huán)節(jié)，而由于受到CpG-DNA半衰期較短和體內(nèi)核酸酶降解的限制，往往使CpG-DNA在以一定免疫途徑進(jìn)入機(jī)體后，很快便被核酸酶降解吸收進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，細(xì)胞的有效攝取率根本無法達(dá)到閾值水平，從而降低了CpG-DNA免疫刺激活性。因此，藥物載體遞呈技術(shù)的應(yīng)用，不僅能夠解決體內(nèi)降解的問題，而且還能有效提高CpG-DNA的免疫刺激活性。這對于有效增強(qiáng)機(jī)體的免疫效應(yīng)、降低刺激性、較快產(chǎn)生抗體以及刺激細(xì)胞免疫具有重要意義。

1 納米載體

遞呈載體納米化處理使得納米粒具有無免疫原性、細(xì)胞毒性；有較高的基因轉(zhuǎn)染效率，可獲得靶基因的長期穩(wěn)定表達(dá)；可保護(hù)藥物或靶基因不受機(jī)體血漿或組織細(xì)胞中多種酶類和補(bǔ)體的破壞。武梅等對納米粒徑的PLG和脂質(zhì)體作為包裝分子包裹含CpG序列的pUC18質(zhì)粒對豬副傷寒疫苗的免疫增效進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，其免疫增強(qiáng)效果同脂質(zhì)體包裹后的免疫佐劑效應(yīng)相似或更強(qiáng)[2]。向一等采用殼聚糖納米粒包裹CpG-DNA聯(lián)合重組乙肝疫苗具有增強(qiáng)免疫抑制小鼠的免疫應(yīng)答能力[3]。彭蓉等也成功地采用殼聚糖納米顆粒（CNP）包裹CpG ODN，并發(fā)現(xiàn)CpG-DNA具有高效誘導(dǎo)小鼠對乙肝疫苗的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，減少佐劑用量[4]。Joseph等以納米粒脂質(zhì)體包裹CpG-DNA，也可以誘導(dǎo)機(jī)體較強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，且共度試驗(yàn)中能夠產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)力[5]。由于納米載體包裹，CpG-DNA在機(jī)體內(nèi)可以誘導(dǎo)高水平的SIgA表達(dá)，可以作為很好的黏膜免疫佐劑[6-7]。這些都提示納米載體的應(yīng)用有利于CpG-DNA的有效遞呈，從而全面增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。

2 脂質(zhì)體和脂質(zhì)體復(fù)合物

脂質(zhì)體作為遞呈載體是臨床應(yīng)用較早且發(fā)展最為成熟的一類新型靶向制劑，具有無毒、無免疫原性、可生物降解等特點(diǎn)。脂質(zhì)體及其脂質(zhì)體復(fù)合物作為DNA載體，可以有效提高免疫佐劑CpGDNA的生物活性，增強(qiáng)APCs的吞噬效應(yīng)，提高其抗原提呈效率和能力；延長體內(nèi)停留時間，形成倉庫效應(yīng)；減少佐劑、疫苗使用量、降低毒副作用等[8-9]。Jaafari等采用水合脫水法將CpG-DNA和利什曼原蟲抗原（rgp63）包裹于脂質(zhì)體中，并免疫BALB/c小鼠，攻毒試驗(yàn)表明，脂質(zhì)體包裹組能夠產(chǎn)生很好的免疫保護(hù)力，提高IgG2a/IgG1和誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的IFN-g[10]。Wilson等人用脂質(zhì)體納米包裹CpG ODN后不同途徑免疫ICR小鼠后觀察其免疫增效作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體不僅能夠顯著提高APCs對CpG-DNA的吞噬，節(jié)約佐劑用量，提高機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫；同時，其藥代動力學(xué)研究結(jié)果表明，包裹后的CpG-DNA的轉(zhuǎn)運(yùn)和分布具有很高的靶向性，且與免疫的途徑具有一定的相關(guān)性[11]。孫瑞林等在探討多聚胺膽固醇陽離子脂質(zhì)體（PCL）與CpG-DNA復(fù)合物對哮喘小鼠肺組織嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）的影響中發(fā)現(xiàn)，PCL霧化介導(dǎo)可以減輕以EOS為特征的炎癥反應(yīng)，利用PCL為轉(zhuǎn)染載體包裹CpG-DNA，可提高轉(zhuǎn)染效率[12]。

3 藻酸鹽微粒

藻酸鹽是一種生物可降解材料，在特定條件或自然條件下能夠被化學(xué)試劑、微生物或酶降解的材料，其具有良好的生物相容性，且降解產(chǎn)物對機(jī)體不產(chǎn)生毒副作用。當(dāng)其作為免疫佐劑CpG-DNA的載體運(yùn)送入機(jī)體，可有效避免核酸酶降解，促進(jìn)抗原和佐劑的共遞呈，并且通過聚合物的降解緩慢釋放包裹的抗原，減少給藥次數(shù)，獲得長期的免疫效果，更能有效地經(jīng)胞吞作用進(jìn)入到鼻相關(guān)淋巴組織（MALT），誘導(dǎo)機(jī)體的黏膜免疫應(yīng)答，可以成為很好的黏膜疫苗制劑。Ferreiro等利用藻酸鹽和多聚賴氨酸制成的嵌段聚合物作為CpG-DNA的載體，可以保護(hù)CpG-DNA在機(jī)體內(nèi)不被降解，提高CpG-DNA的穩(wěn)定性，從而保證其免疫刺激活性的正常發(fā)揮[13]。Tafaghodi等利用藻酸鹽包封破傷風(fēng)內(nèi)毒素（TT）和CpG-DNA兩種物質(zhì)通過鼻免疫患白化病的兔子進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，包封后組血清中IgG水平顯著高于其他組別且人體試驗(yàn)結(jié)果表明，包封能夠避免紅細(xì)胞溶血和鼻刺激黏液物的產(chǎn)生[14]。有報道指出，利用藻酸鹽-殼聚糖載體系統(tǒng)包裹CpG-DNA和肝炎細(xì)胞B表面抗原免疫機(jī)體后，免疫協(xié)同CpG-DNA的免疫刺激活性，誘導(dǎo)高水平IFN-g和偏Th1型的抗原特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)；同時，緩控釋抗原-佐劑復(fù)合物的釋放和遞呈[15]。

4 陽離子高聚物

陽離子高聚物通過電荷相互作用與帶負(fù)電的CpG-DNA分子形成聚電解質(zhì)復(fù)合體，復(fù)合物通過內(nèi)吞作用進(jìn)入靶細(xì)胞，然后發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。這些陽離子高聚物內(nèi)的氨基在生理pH下會發(fā)生質(zhì)子化。質(zhì)子化的氨基可以中和CpG-DNA質(zhì)粒表面的負(fù)電荷，使DNA分子壓縮為體積相對較小的粒子結(jié)構(gòu)，從而使DNA免受核酸酶的降解。陽離子高分子載體種類很多，以殼聚糖為代表的天然陽離子是一種非常具有應(yīng)用潛力的非病毒類基因載體，有良好的生物相容性和可降解性，其結(jié)構(gòu)中的游離氨基在酸性條件下可結(jié)合氫離子形成帶正電的多聚物，可與帶負(fù)電的DNA分子形成復(fù)合物，在體內(nèi)保護(hù)DNA免受核酸酶降解，充分利用CpG-DNA的免疫活性，增強(qiáng)免疫應(yīng)答效應(yīng)。呂學(xué)斌等制備了聚乙交酯丙交酯（PLG）納米顆粒，比較了陽離子PLG納米顆粒和脂質(zhì)體作為載體包裹CpG分子對小鼠體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽離子PLG納米顆粒包裹后顯著提高免疫小鼠總IgG，小鼠免疫細(xì)胞數(shù)量明顯增加，淋巴細(xì)胞增殖活性及IL-2的誘生活性增強(qiáng)；同陽離子脂質(zhì)體的效應(yīng)相似或較強(qiáng)，能顯著提高裸CpG質(zhì)粒的免疫增強(qiáng)活性[16]。陳曉琦等采用含編碼呼吸道合胞病毒（RSV）抗原質(zhì)粒DNA的脫乙酰殼多糖DNA納球，試驗(yàn)證明其能夠有效預(yù)防急性RSV的感染[17]。Xie等采用聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）載體吸附CpG-DNA聯(lián)合鋁制炭疽苗免疫機(jī)體后發(fā)現(xiàn)，與CpG-DNA和疫苗混合組、疫苗組相比，加入PLGA免疫組的免疫應(yīng)答水平顯著高于其他兩組，且具有很好免疫保護(hù)作用[18]。祁智等應(yīng)用殼聚糖（CS）包載 CpG-DNA，制備 CS-CpG-DNA基因載體，不僅提高了CpG-DNA對裂解酶的穩(wěn)定性；同時，由于殼聚糖的天然免疫活性，協(xié)同增強(qiáng)了CpG-DNA的免疫作用能力，產(chǎn)生了更強(qiáng)更持久的免疫應(yīng)答[19]。另外，溴化十六烷基三甲基胺（CTAB）、溴化十六烷基二甲基乙基銨（CDAB）、雙十二烷基二甲基溴化銨（DDAB）、多聚-L-賴氨酸（PLL）、聚乙烯亞胺（PEI）等化學(xué)合成試劑也是很好的陽離子遞呈載體材料。其作為CpG-DNA和抗原的遞呈載體，同樣能夠有效提高CpG-DNA的佐劑效應(yīng)，同時兼具靶向、緩釋、長效的作用特點(diǎn)。

5 小結(jié)

理想的載體應(yīng)具備靶向特異性，并且可被免疫系統(tǒng)識別；藥物釋放可控緩釋性，能在導(dǎo)入部位形成“抗原貯存庫”效應(yīng)；高度穩(wěn)定，容易制備，可濃縮和純化；無毒性，對病人及環(huán)境安全無害；具有免疫協(xié)同效應(yīng)。目前，我國關(guān)于免疫佐劑CpG-DNA遞呈載體的研究還處于起步階段，尚存在許多空白和需完善的地方。此外，CpGDNA的安全問題仍然是一個不能忽視的問題。所以，今后應(yīng)著眼于載體、佐劑、抗原三者之間的配比，最適宜的免疫途徑以及載體材料的選擇對免疫刺激的影響等多方向研究。力求從藥動學(xué)、藥效學(xué)、免疫學(xué)等理論的多角度進(jìn)行多分析。相信隨著CpG-DNA作用機(jī)制的不斷清晰，CpGDNA遞呈載體的研究不斷完善和發(fā)展，開發(fā)出更適合CpG-DNA臨床應(yīng)用的載體系統(tǒng)，使其在消滅和控制傳染病、寄生蟲病以及自身免疫性疾病中便能發(fā)揮極為重要的作用，顯示出極強(qiáng)的使用價值和廣闊的應(yīng)用前景。

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