崔書霞 郝志梅 郭志義 郝小惠 王素云 田 煒

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，近年來隨著社會的老齡化和飲食習(xí)慣的西方化，PCa的發(fā)病率顯著增高[1]。目前普遍認(rèn)為PCa為雄激素依賴性腫瘤，其發(fā)生與雄激素的刺激有關(guān)，雄激素受體（adrogen receptor，AR）在介導(dǎo)雄激素生物學(xué)效應(yīng)上發(fā)揮著重要作用[2]。泌乳素相關(guān)蛋白（prolactin inducible protein，PIP）是一種15～17 ku的糖蛋白[3]，廣泛存在于精液、唾液、乳汁等體液中，并發(fā)揮著多種生物學(xué)作用[4]。PIP可作為一種腫瘤標(biāo)志物被用來診斷乳腺來源的轉(zhuǎn)移癌[5]。最近研究發(fā)現(xiàn)，前列腺上皮細胞也能產(chǎn)生PIP，在前列腺癌中PIP有過度表達，并與前列腺特異抗原（PSA）存在共表達[6-7]。本研究探討PIP在前列腺癌細胞系中的表達情況，以及雄激素對其表達的影響，為進一步探討前列腺癌的發(fā)病機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人前列腺癌細胞系LNCaP、PC-3、DU145及人乳腺癌細胞系T47D均購自中國科學(xué)院細胞庫。兔抗人GCDFP-15（PIP）多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，鼠源GAPDH多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG及辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自中杉金橋生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 于含10%胎牛血清（FBS）、雙抗（青霉素100 U/mL， 鏈霉素 100 mg/L） 的 RPMI1640 （LNCaP、PC-3、DU145）或 DMEM（T47D）培養(yǎng)基中，置于 37 ℃、5%CO2、飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。細胞生長狀態(tài)良好，達到對數(shù)生長期時，將細胞按1×104/mL接種于培養(yǎng)瓶或6孔板內(nèi)，孵箱孵育24 h后待用。

1.2.2 處理及分組 各培養(yǎng)細胞系分為空白對照組、不同濃度及不同時間處理組，不同濃度處理組應(yīng)用（0.1、1、10、100 nmol/L） 雙 氫 睪 酮 （Dihydrotestosterone，DHT） 或 睪 酮（Testosterone，T）分別對各細胞系進行處理，不同時間處理組為應(yīng)用10 nmol/L DHT或T處理6、24和48 h。

1.2.3 引物設(shè)計 通過NCBI基因庫獲得各目標(biāo)基因序列，使用Primer Premier 5.0引物設(shè)計軟件 （Premier公司，加拿大）設(shè)計引物，由Invitrogen公司合成，設(shè) glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）為內(nèi)參，各引物序列見表1。

Table 1 Primer sequences of PIP,AR and GAPDH genes表 1 PIP、AR和GAPDH基因特異性引物序列

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR） 取各組培養(yǎng)細胞，用Trizol抽提法提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA純度，-70℃凍存待用。用Oligo（dT）、隨機引物、逆轉(zhuǎn)錄酶（Takara）等進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。使用各基因特異性引物，應(yīng)用RT-PCR二步法試劑盒（Takara公司Ver2.1）進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物應(yīng)用1.5%瓊脂糖凝膠在100 V電壓下電泳確認(rèn)。

1.2.5 實時熒光定量PCR 將1.2.4中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的cDNA用各目標(biāo)基因的特異性引物，使用Rotor-Gene Multiplex RT-PCR Kit（Qiagen）試劑盒，Rotor-Gene 3000 定量PCR儀（Corbett Robotics公司，澳大利亞）對各基因進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為94℃15 s,56℃25 s,72℃20 s，40個循環(huán)。所獲得的PCR產(chǎn)物應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)確認(rèn)，同時使用各待測基因分別制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對所獲得的定量數(shù)據(jù)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進行相對定量分析，使用GAPDH作為管家基因，實驗至少重復(fù)3次。

1.2.6 蛋白提取 將處于對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的各組細胞，用 10 g/L的 NP40細胞裂解液（10 g/L NP40，pH 7.4 Tris堿 50 mmol/L，NaCl 150 mmol/L，1 g/L SDS，5 g/L 脫氧 膽酸鹽，200 mg/L苯甲基磺酰氟，50 mg/L抑肽酶）裂解細胞，冰上震蕩裂解30 min，4℃12 000 r/min離心10 min。將離心后的上清分裝至0.5 mL Ep管中，BCA蛋白濃度測定試劑盒 （碧云天生物技術(shù)研究所）定量，-80℃保存待用。

1.2.7 Western blot 按照每孔 20 μg蛋白量上樣，SDSPAGE 100 V電壓電泳，8 mA/cm2電流半干轉(zhuǎn)印2 h將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5 g/L脫脂奶粉封閉2 h后，加入GCDFP-15（PIP）或GAPDH抗體工作液，4℃孵育過夜，TBST充分洗膜后加入辣根過氧化酶標(biāo)記二抗室溫孵育2 h，BeyoECL Plus（碧云天生物技術(shù)研究所）化學(xué)發(fā)光顯色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示，組間比較應(yīng)用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各細胞系PIP的表達 在LNCaP及T47D細胞中有PIP mRNA及PIP蛋白的表達，但LNCaP細胞中的PIP表達量低于T47D細胞；而在PC-3及DU145細胞中無PIP mRNA和PIP蛋白的表達，見圖1、2。在LNCaP與T47D中有AR mRNA表達，且表達量相近，而在PC-3與DU145中AR表達較少或無AR表達，見圖1。經(jīng)實時熒光定量PCR確認(rèn)LNCaP細胞中的PIP表達量約為T47D細胞的1/600。

Figure 1 PIP and AR mRNA expressions in four cell lines圖1 PIP及AR mRNA在4種細胞系中的表達

Figure 2 PIP expression in four cell lines by Western blot analysis圖2 PIP蛋白在4種細胞系中的表達

2.2 雄激素對LNCaP及T47D中PIP mRNA表達的影響 PIP mRNA的表達隨DHT或T濃度增加而增加，且DHT或T濃度達到10 nmol/L時PIP mRNA的表達量最大，與對照組（0 nmol/L）相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表2。經(jīng)10 nmol/L DHT或T處理后24 h內(nèi)LNCaP細胞中PIP mRNA的表達隨時間的延長而增加，于24 h時達到最大峰值，與對照組（0 h）相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表3。

Table 2 PIP mRNA expressions of LNCaP and T47D cell lines stimulated by different concentrations of DHT or T表2 不同濃度DHT或T對LNCaP及T47D細胞系中PIP mRNA表達的影響 （PIP/GAPDH±s）

Table 2 PIP mRNA expressions of LNCaP and T47D cell lines stimulated by different concentrations of DHT or T表2 不同濃度DHT或T對LNCaP及T47D細胞系中PIP mRNA表達的影響 （PIP/GAPDH±s）

*P<0.05，**P<0.01；t值為各濃度組與0 nmol/L組比較，表4同

濃度（nmol/L）0 0.1 1 10 100 55555 DHT 1.000±0.242 1.033±0.176 2.391±0.084 3.338±0.024 1.734±0.008 t -0.146 15.036**15.732**3.062*T 1.000±0.242 1.020±0.036 2.557±0.031 3.496±0.366 1.636±0.012 t -0.148 9.884*10.479**4.387*LNCaP n濃度（nmol/L）0 0.1 1 10 100 55555 DHT 1.000±0.065 0.957±0.079 2.153±0.182 3.411±0.073 1.707±0.185 t -0.653 9.861*30.506**5.637*T 1.000±0.065 0.843±0.117 1.997±0.142 3.837±0.186 2.302±0.279 t -1.562 19.118**39.709**6.723*T47D n

Table 3 PIP mRNA levels of LNCaP and T47D cell lines stimulated by different times of 10 nmol/L DHT or T表3 10 nmol/L DHT或T處理不同時間對LNCaP及T47D細胞系中PIP mRNA表達的影響（PIP/GAPDHs）

Table 3 PIP mRNA levels of LNCaP and T47D cell lines stimulated by different times of 10 nmol/L DHT or T表3 10 nmol/L DHT或T處理不同時間對LNCaP及T47D細胞系中PIP mRNA表達的影響（PIP/GAPDHs）

*P<0.05；t值為各時點組與0 h組比較，表5同

時間（h）062 4 48 5555 DHT 1.000±0.348 1.465±0.435 3.487±0.047 2.516±0.429 t -1.031 13.516*3.507 T 1.000±0.348 1.745±0.581 3.303±0.278 2.319±0.398 t -1.475 7.503*3.220 LNCaP n 5555 DHT 1.000±0.621 1.650±0.346 3.411±0.073 2.303±0.096 t -1.226 6.036*3.730 T 1.000±0.621 1.064±0.213 3.670±0.164 2.033±0.167 t -0.256 6.369*2.600 T47D n時間（h）062 4 48

2.3 雄激素對LNCaP及T47D中AR mRNA表達的影響 對LNCaP及T47D細胞給予不同濃度或不同時間DHT或T處理，AR mRNA的表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均 P>0.05），見表 4、5。

Table 4 AR mRNA levels of LNcap and T47D cell lines stimulated by different concentrations of DHT or T表4 不同濃度DHT或T對LNCaP及T47D細胞系中AR mRNA表達的影響 （PIP/GAPDHs）

Table 4 AR mRNA levels of LNcap and T47D cell lines stimulated by different concentrations of DHT or T表4 不同濃度DHT或T對LNCaP及T47D細胞系中AR mRNA表達的影響 （PIP/GAPDHs）

均P>0.05

濃度（nmol/L）0 0.1 1 10 100 55555 DHT 1.000±0.594 0.969±0.204 0.732±0.221 0.586±0.553 0.432±0.402 t -0.085 1.073 1.113 1.024 T 1.000±0.594 1.094±0.217 0.989±0.817 0.900±0.260 0.722±0.308 t -0.202 0.014 0.219 1.478 LNCaP n濃度（nmol/L）0 0.1 1 10 100 55555 DHT 1.000±0.318 0.815±0.127 0.807±0.126 0.580±0.012 0.696±0.109 t -1.080 0.965 2.381 1.236 T 1.000±0.318 0.895±0.125 0.774±0.287 0.785±0.087 0.752±0.229 t -0.672 0.443 0.358 0.513 T47D n

Table 5 AR mRNA level of LNcap and T47D cell lines stimulated by different times of 10 nmol/L DHT or T表5 10 nmol/L DHT或T處理不同時間對LNCaP及T47D細胞系中AR mRNA表達的影響（PIP/GAPDHs）

Table 5 AR mRNA level of LNcap and T47D cell lines stimulated by different times of 10 nmol/L DHT or T表5 10 nmol/L DHT或T處理不同時間對LNCaP及T47D細胞系中AR mRNA表達的影響（PIP/GAPDHs）

均P>0.05

時間（h）062 4 48 5555 DHT 1.000±0.710 0.976±0.751 0.492±0.464 0.493±0.244 t -0.050 0.901 0.929 T 1.000±0.710 1.079±0.695 0.755±0.218 0.300±0.147 t -0.987 0.457 1.423 LNCaP n 5555 DHT 1.000±0.083 0.949±0.062 0.780±0.012 1.136±0.271 t -0.614 4.042 1.246 T 1.000±0.083 0.785±0.228 0.785±0.087 1.227±0.181 t -1.205 3.698 1.636 T47D n時間（h）062 4 48

3 討論

PIP雖是一種小分子糖蛋白，但卻在腫瘤，尤其在乳腺癌和前列腺癌的增生和轉(zhuǎn)移過程起作用，在免疫反應(yīng)、抗菌、受精及細胞凋亡等方面也具有重要作用[4]，并且PIP在乳腺癌中的過表達和癌的預(yù)后有關(guān)[7]。前期研究中已經(jīng)證實PIP在正常前列腺組織中有表達，而且在前列腺癌中過表達[6]。本研究結(jié)果顯示PIP在雄激素依賴性PCa細胞LNCaP中表達，進一步證實了PIP與PCa發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

體外培養(yǎng)前列腺癌細胞發(fā)現(xiàn)，雄激素對其生長有雙相作用，一定濃度范圍的雄激素刺激前列腺癌細胞（如LNCaP）的生長，過大劑量雄激素則抑制其生長，而過低濃度的雄激素則對癌細胞的生長沒有促進作用[8]。研究表明，在乳腺癌細胞系T47D中PIP的過表達受雄激素調(diào)節(jié)[9]。本研究結(jié)果顯示，PIP的表達隨雄激素的濃度增加而增加，當(dāng)雄激素超過一定濃度時反而不能使PIP過度表達，說明PIP與LNCaP細胞的生長進程密切相關(guān)。結(jié)果還顯示，PIP在雄激素依賴性PCa細胞LNCaP中表達，而在雄激素非依賴性PCa細胞PC-3和DU145中不表達，更加證實了PIP的表達受到雄激素的調(diào)控，并且提示雄激素依賴性PCa與雄激素非依賴性PCa的發(fā)生發(fā)展機制有所不同，PIP或許可以成為一種鑒別手段應(yīng)用于臨床。

研究認(rèn)為，PIP基因上存在雄激素受體反應(yīng)元件（androgen responsive element，ARE），而 AR 正是通過ARE作用于相關(guān)靶基因，從而介導(dǎo)產(chǎn)生雄激素生物學(xué)效應(yīng)的[10]。當(dāng)AR與雄激素配基結(jié)合后，AR構(gòu)象發(fā)生改變形成同型二聚體并發(fā)生核轉(zhuǎn)位反應(yīng)，由胞漿轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，識別并特異結(jié)合ARE，募集調(diào)節(jié)因子形成多蛋白復(fù)合體，該蛋白復(fù)合體與轉(zhuǎn)錄因子和基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄裝置相互作用從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[11]。目前研究認(rèn)為，PCa與AR基因突變、擴增和表達缺失有關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，AR的表達并未隨雄激素濃度及時間而增加，說明雄激素并非通過使AR增加來調(diào)控PIP的表達，或許是通過AR基因突變增加了其與雄激素及ARE的反應(yīng)性，從而使PIP表達增多。

綜上所述，PIP在雄激素依賴性前列腺癌細胞（LNCaP）及雄激素非依賴性前列腺癌細胞（PC-3、DU145）中的表達有差異，PIP的表達受到雄激素的調(diào)控作用，但雄激素的這一作用并非通過AR表達的增加來實現(xiàn)。PIP或許在前列腺癌發(fā)生發(fā)展進程中，以及鑒別前列腺癌是否具有雄激素依賴性方面有一定作用。

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