趙鯤鵬

本實驗旨在探討?zhàn)B陰柔肝活血法與活化的肝星狀細胞分泌的PDGF及其受體PDGFR的相關性，進而闡明其抗酒精性肝纖維化的作用機制。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠60只，體重200±20g，購自甘肅中醫(yī)學院實驗動物中心。

1.1.2 實驗藥品和主要試劑 養(yǎng)陰柔肝活血法方藥制劑由甘肅中醫(yī)學院附屬醫(yī)院制劑室根據(jù)配方制作而成;白酒(乙醇)為北京釀酒總廠出品的56度紅星牌二鍋頭白酒;橄欖油由上海中秦化學試劑有限公司提供;鱉甲煎丸為武漢中聯(lián)藥業(yè)集團股份有限公司產品，國藥準字z42020772;吡唑為新沂市匯力精細化工有限公司產品;高脂飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司根據(jù)配方(87.5%基礎飼料+2%膽固醇+10%豬油+0.5%膽鹽)生產;PDGF_BB及PDGFR_β試劑盒由西安科昊生物工程有限責任公司提供;四氯化碳由煙臺市雙雙化工有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 造模方法與分組處理 首先制備“乙醇-橄欖油-吡唑”混懸液［60%酒精8ml/(kg·d)］、橄欖油2ml/(kg·d)、吡唑25mg/(kg·d)］，CCl4橄欖油注射液(CCl4∶橄欖油=1∶3);對大鼠進行混懸液灌胃，并間斷飼高脂飼料，結合微量CCl4腹腔注射的復合模式造酒精性肝纖維化病理模型，造模方法參照文獻［1］并略加改進。60只Wistar雄性大鼠適應性喂養(yǎng)3天后隨機分為6組，即正常組10只，造模組50只。①正常組:大鼠普通喂養(yǎng)，生理鹽水灌胃10ml/(kg·d)×12周;第2周起予以0.3 ml/kg劑量的生理鹽水腹腔注射，每周2次，至第8周末結束。②造模組大鼠酒精混懸液灌胃，第1周6ml/(kg·d)，第 2周 8ml/(kg·d)，第 3 周 10ml/(kg·d)，以后維持此量，直至造模8周末結束。另外第2周起按0.3ml/(kg·d)劑量腹腔注射微量CCl4橄欖油溶液，2次/周，至第8周末結束;同時隔周間斷性飼喂高脂飼料。③第8周末造模組50只大鼠隨機分為5組，即模型組、鱉甲煎丸治療組、養(yǎng)陰柔肝活血法高、中、低劑量治療組，每組10只。④各治療組于造模8周后給藥，1次/日，每天同一時間灌胃，連續(xù)4周，分別根據(jù)大鼠具體體重確定藥量(按體重換算)，每(3～4)日稱體重后調整劑量。

養(yǎng)陰柔肝活血方藥物制備方法:麥冬15g，當歸15g，柴胡12g，白芍 10g，枳實 10g，梔子 10g，枳椇子 10g，黃芪 12g，炙鱉甲10g，丹參12g，蒼術10g，白寇10g，茯苓15g。每劑藥頭煎加水500ml，煮取300ml;二煎加水300ml，煮取200ml;兩煎相合，去渣再煎至400ml。所有藥物均購自甘肅中醫(yī)學院附屬醫(yī)院中藥房，由甘肅中醫(yī)學院附屬醫(yī)院制劑室研究室加工成中藥浸膏(每克浸膏相當于生藥3.28g)，4℃貯存?zhèn)溆茫们鞍幢壤睇}水稀釋。

用藥劑量:參考人的臨床用量確定小、中、大3個灌胃給藥劑量。養(yǎng)陰柔肝活血方中藥浸膏(3.28g)，人臨床生藥量1g/(kg·d)，人臨床生藥量的5倍即為大鼠灌胃量的中劑量［5g/(kg·d)］，經計算調養(yǎng)陰柔肝活血方大鼠灌胃中劑量為1.5g/(kg·d)中藥浸膏，小劑量為0.75g/(kg·d)中藥浸膏，大劑量為3.0g/(kg·d)中藥浸膏，相當于人臨床給藥量的5倍，2.5倍，10倍，中藥對照藥(鱉甲煎丸)灌胃給藥量為0.25g/(kg·d)，相當于人的臨床用量的5倍，模型組予生理鹽水10ml/(kg·d)灌胃，治療時間為4周。

1.2.2 收集標本 實驗第12周末，均于末次給藥后24小時，禁食12小時，動物斷頸處死。統(tǒng)一留取大鼠肝左葉組織，加入一定量的PBS(pH7.4)，冰浴中制成肝組織勻漿。離心3000轉/分×20分鐘。收集上清液，分裝待測。

1.2.3 指標檢測

1.2.3.1 大鼠PDGF檢測方法 嚴格按照大鼠PDGF檢測試劑盒說明書要求操作。具體操作步驟如下:①提前20分鐘將試劑盒取出放置在室溫下。②從已平衡至室溫的密封袋中取出板條。③標準品的稀釋與加樣:在酶標包被板上設標準品孔14孔，在第一、第二孔中分別加標準品100μl，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻;然后從第一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻;混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九、第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九、第十孔中各取50μl分別加到第十一、第十二孔中，再在第十一、第十二孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第十一、第十二孔中分別取50μl加到第十三、第十四孔中，再在第十三、第十四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第十三、第十四孔中各取50μl棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為36ng/L，24ng/L，12ng/L，6ng/L，3ng/L，1.5ng/L，0.75ng/L)。④加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后將所有實驗組大鼠肝組織勻漿液加入到相應的孔中，每孔加入10μl，輕輕晃動混勻。⑤溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。⑥ 配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。⑦洗滌:小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。⑧加酶:每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。⑨溫育:操作同3。⑩洗滌:操作同5。? 顯色:每孔先加入顯色劑 A 50μl，再加入顯色劑 B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。? 終止:每孔加終止液50μl，終止反應。?測定:以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。?標準品制定標準曲線，根據(jù)標準曲線獲得每只大鼠肝組織勻漿液中具體的PDGF濃度。

1.2.3.2 大鼠PDGFR檢測方法 具體操作如大鼠PDGF檢測步驟，只是標準品的稀釋與加樣后，濃度分別為1200ng/L，800ng/L，400ng/L，200ng/L，100ng/L，50ng/L，25ng/L。

2.結果

養(yǎng)陰柔肝活血法對酒精性肝纖維化大鼠肝臟HSC中PDGF及PDGFR相對濃度的影響，見表1。

實驗結果顯示，模型組PDGF及PDGFR平均濃度顯著高于正常組及養(yǎng)陰柔肝活血法高、中劑量組，差異有極顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.001);鱉甲煎丸組、養(yǎng)陰柔肝活血法低劑量組PDGF及PDGFR平均濃度均顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);養(yǎng)陰柔肝活血法中劑量組PDGF及PDGFR平均濃度明顯低于鱉甲煎丸組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);養(yǎng)陰柔肝活血法高、低劑量組與鱉甲煎丸組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);養(yǎng)陰柔肝活血法中劑量組降低PDGF及PDGFR的效果優(yōu)于高、低劑量組。

表1 各組PDGF及PDGFR的平均濃度

3.討論

PDGF是目前已知的HSC最強的促分裂素，以激活HSC并促進其增殖、轉化為主，也可促進其產生膠原［2］。PDGF必須與細胞膜上的相應受體結合后才能發(fā)揮其生物學效應，PDGF受體由兩種亞單位α及β構成，激活的HSC才表達β亞單位［3］。國內外研究者普遍認為PDGF-BB及PDGFR-β在肝纖維化過程中的作用尤為突出。故了解PDGF及PDGFR在酒精性肝病的發(fā)生發(fā)展中的表達變化，將有助于解釋酒精性肝纖維化的發(fā)病機制及中藥治療該病的療效機理?；谝陨侠碚摚覀冞x取PDGF及PDGFR研究對象，通過探索養(yǎng)陰柔肝活血法抑制肝纖維化形成過程中PDGF及PDGFR的變化，以期為養(yǎng)陰柔肝活血法的靶向作用提供理論依據(jù)。結果顯示PDGF及PDGFR在各治療組的表達較模型組減少，且均有顯著性差異。提示降低PDGF及PDGFR在肝組織中的表達，從而抑制HSC的激活、增殖以及細胞外基質的合成，可能是養(yǎng)陰柔肝活血法發(fā)揮抗肝纖維化作用機制之一。

1 楊華，張麗軍，馮艷玲，彭秀華，周文江.酒精復合性肝纖維化大鼠模型的建立及動態(tài)觀察［J］.實驗動物與比較醫(yī)學，2008，28(4):234-237.

2 LI RONG，ZHAO MENYUN.Effects of Astragalus herb soup on expression of TGF- β1，CTGF and PDGF-BB in experimental hepatic fibrotic rats［J］.Proceeding of clinical medicine，2006，15(9):659-661.

3 Wong L，Yamasaki G，Johnson RJ，F(xiàn)riedman SL.Induction of betaplatelet-derived growth factor receptor in rat hepatic lipocytes during cellular activation in vivo and in culture.J Clin Invest 1994;94:1563-1569.