王洪武， 李守超， 王光勇， 余楓華， 曾 曉， 狄國杰， 徐媛青， 袁 丁，張長城*

(1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北宜昌443002;2.宜昌市夷陵區(qū)人民醫(yī)院，湖北宜昌443100;3.宜昌市疾病預(yù)防控制中心，湖北宜昌443003)

環(huán)磷酰胺是臨床用于腫瘤化療的常用藥物，但其骨髓抑制、免疫低下等毒副作用限制了環(huán)磷酰胺在臨床的廣泛使用。五子衍宗方由枸杞子、菟絲子 (炒)、覆盆子、五味子 (蒸)、車前子 (鹽炒)組成，具有補(bǔ)腎益精之功效，本課題近期研究顯示五子衍宗方具有較好的免疫調(diào)節(jié)作用，可顯著改善環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠的免疫功能［1］。但五子衍宗方能否減輕環(huán)磷酰胺在腫瘤化療過程中的毒副作用尚未明晰，本研究擬建立H22荷瘤小鼠模型，采用環(huán)磷酰胺聯(lián)合五子衍宗方治療，以研究五子衍宗方對環(huán)磷酰胺化療的減毒作用。

1 材料

1.1 試劑 流式熒光抗體Anti-Mouse CD19(FITC)，Anti-MouseCD69(PE-Cy5)，Anti-Mouse CD4(PE)，Anti-Mouse CD8a(FITC)，以上試劑均購于 eBioscience公司，批號Cat.11-0191。

1.2 動物 BalB/c種雄性小鼠，SPF級，8～9周齡，22～25 g，湖北省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(鄂)2008-0005。

1.3 藥物 五子衍宗方由枸杞子、菟絲子、覆盆子、五味子、車前子組成，全部生藥經(jīng)三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院汪鋆植教授鑒定為正品，取枸杞子400 g，菟絲子 (炒)400 g，覆盆子200 g，五味子 (蒸)50 g，車前子 (鹽炒)100 g，按照傳統(tǒng)方法煎取，濃縮至粉末，提取率為40.7%，臨用前配成相應(yīng)濃度的溶液;注射用環(huán)磷酰胺 (環(huán)磷酰胺)，規(guī)格為0.2 g，批號08121021，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

1.4 儀器 超凈工作臺 (上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);CKX41型倒置顯微鏡 (日本OLYMPUS公司);XW-80A微型旋渦混合儀 (上海滬西分析儀器廠有限公司);TD-WS湘儀離心機(jī) (孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司);JA2003型電子分析天平 (上海天平儀器廠);流式細(xì)胞儀(美國BD FACACalibur)。

2 方法

2.1 H22荷瘤小鼠模型的建立 無菌條件下，將復(fù)蘇的H22肝癌細(xì)胞注入小鼠腹腔，7 d后抽取小鼠腹水，并用無菌PBS稀釋4倍，反復(fù)沖打、并混勻，在顯微鏡下計數(shù)，用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至3×107mL－1，取0.1 mL于各小鼠右側(cè)腋窩下碘伏消毒后皮下接種，從接種第一只小鼠開始到最后一只的總時間控制在30 min內(nèi)。

2.2 分組及給藥 實(shí)驗(yàn)小鼠接種H22后，隨機(jī)分為4組，每組10只，即荷瘤對照組、環(huán)磷酰胺組、環(huán)磷酸胺加五子衍宗方高劑量組 (840 mg/kg)、環(huán)磷酸胺加五子衍宗方低劑量組 (420 mg/kg)。各組于接種第2天分別灌胃給藥。環(huán)磷酸胺組、環(huán)磷酸胺加五子衍宗方高劑量組和環(huán)磷酸胺加五子衍宗方低劑量組分別給予小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg，隔天1次，共注射5次;環(huán)磷酸胺加五子衍宗方高劑量組和環(huán)磷酸胺加五子衍宗方低劑量組分別給予五子衍宗方提取物840 mg/kg(生藥量為2.06 g/kg)和420 mg/kg灌胃 (生藥量為1.03 g/kg)，每天1次，共10次;荷瘤對照組與環(huán)磷酸胺組給予等劑量生理鹽水灌胃。

2.3 外周血WBC、RBC、PLT數(shù)量檢測 末次給藥24 h后，小鼠眼眶靜脈叢取血，測血象，檢測指標(biāo)為白細(xì)胞總數(shù) (WBC)，紅細(xì)胞總數(shù) (RBC)，血小板總數(shù) (PLT)。

2.4 骨髓有核細(xì)胞計數(shù) 取小鼠一側(cè)完整股骨，除凈軟組織，用PBS將全部骨髓沖洗至離心管，定容至5 mL。計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×107mL－1。

2.5 臟器指數(shù)及抑瘤率的測定 末次給藥24 h后稱定質(zhì)量，處死小鼠，取脾并稱濕質(zhì)量，以小鼠脾質(zhì)量/體質(zhì)量(mg/g)作為脾臟指數(shù)。并剝離瘤塊，稱瘤質(zhì)量，按平均瘤質(zhì)量計算抑瘤率。

抑瘤率 (%)=(對照組平均瘤質(zhì)量－治療組平均瘤質(zhì)量)/對照組平均瘤質(zhì)量×100%

2.6 小鼠脾臟細(xì)胞絕對計數(shù) 取小鼠脾臟，置于覆蓋有200目鋼網(wǎng)的10 mL小燒杯上，用1 mL pH 7.3的PBS潤濕鋼網(wǎng)，另取用1 mL pH 7.3的PBS潤濕脾臟，眼科剪剪碎，并用注射器橡膠塞將小鼠脾臟碾碎，用2 mL PBS將碾碎后小鼠脾臟沖入小燒杯內(nèi)，制成脾細(xì)胞懸液，離心、棄上清加2 mL紅細(xì)胞裂解液，渦旋儀混勻，避光孵育5～8 min，離心、棄上清，加3 mL PBS重懸，離心、棄上清，加3 mL PBS重懸，再離心、棄上清，用8 mL PBS重懸，調(diào)整脾臟細(xì)胞濃度為1×107/mL，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)。

2.7 流式細(xì)胞儀檢測脾中CD4+、CD8+和CD4+CD69+數(shù)量，及CD19+細(xì)胞數(shù)量 取上述制備的脾臟細(xì)胞懸液400 μL，流式細(xì)胞術(shù)檢測首先在FFC和SSC中圈選淋巴細(xì)胞，再圈選細(xì)胞，CD4+T、CD8+T細(xì)胞和CD19+T細(xì)胞并檢測細(xì)胞比例，同樣步驟檢測CD4+CD69+比例。將各亞群的比例和細(xì)胞總數(shù)，換算成其各亞群絕對數(shù)量［2］。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計，資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s)表示，采用t檢驗(yàn)觀察其組間差異。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 對環(huán)磷酰胺化療荷瘤小鼠WBC、RBC、PLT及骨髓有核細(xì)胞數(shù)量的影響 環(huán)磷酰胺組外周血紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板數(shù)量較荷瘤對照組顯著性減少，小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)量較荷瘤對照組亦顯著降低;環(huán)磷酰胺加五子衍宗方高、低劑量組小鼠外周血紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板數(shù)量較環(huán)磷酰胺組小鼠顯著增加，骨髓有核細(xì)胞數(shù)量亦比環(huán)磷酰胺組明顯增多。結(jié)果見表1。

表1 對環(huán)磷酰胺化療荷瘤小鼠WBC、RBC、PLT及骨髓有核細(xì)胞數(shù)量的影響(±s，n=10)

表1 對環(huán)磷酰胺化療荷瘤小鼠WBC、RBC、PLT及骨髓有核細(xì)胞數(shù)量的影響(±s，n=10)

注:與荷瘤對照組相比，##P＜0.01;與環(huán)磷酰胺組相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組 別 劑量/(g·kg－1)WBC/(×109·L－1)RBC/(×1012·L－1)PLT/(×109·L－1) 骨髓有核細(xì)胞數(shù)量/×106荷瘤對照組 － 2.90±0.24 4.38±0.11 803.00±21.82 862.85±126.98環(huán)磷酰胺組 0.05 1.38±0.16## 3.56±0.06## 676.00±31.12## 486.25±97.54#環(huán)磷酰胺+五子衍宗方組(低劑量) 0.05+0.42 1.66±0.24##* 3.74±0.09##* 711.00±25.58##* 535.00±32.08#環(huán)磷酰胺+五子衍宗方組(高劑量) 0.05+0.84 1.67±0.32##* 3.88±0.08##* 794.00±32.19＊＊ 673.75±78.24#*

3.2 對環(huán)磷酰胺化療荷瘤小鼠瘤質(zhì)量和抑瘤率的影響環(huán)磷酰胺加五子衍宗方高、低劑量組和環(huán)磷酰胺組小鼠瘤質(zhì)量明顯低于荷瘤對照組;環(huán)磷酰胺加五子衍宗方高、低劑量組小鼠瘤質(zhì)量均低于單獨(dú)使用環(huán)磷酰胺組。但無統(tǒng)計學(xué)差異，提示五子衍宗方對環(huán)磷酰胺抑瘤率無負(fù)向影響。結(jié)果見表2。

表2 對H22荷瘤小鼠瘤質(zhì)量和抑瘤率的影響(±s，n=10)

表2 對H22荷瘤小鼠瘤質(zhì)量和抑瘤率的影響(±s，n=10)

注:與荷瘤對照組相比，##P＜0.01;與環(huán)磷酰胺組相比，＊＊P＜0.01。

組別 劑量/(g·kg －1)平均瘤質(zhì)量/g平均抑瘤率/%荷瘤對照組 － 1.73±0.19＊＊ －環(huán)磷酰胺組 0.05 0.80±0.15## 53.55環(huán)磷酰胺+五子衍宗方組(低劑量) 0.05+0.42 0.77±0.10## 55.4957.95環(huán)磷酰胺+五子衍宗方組(高劑量) 0.05+0.84 0.73±0.11##

3.3 對環(huán)磷酰胺化療荷瘤小鼠脾臟指數(shù)、脾細(xì)胞絕對數(shù)量及相對數(shù)量的影響 荷瘤小鼠經(jīng)環(huán)磷酰胺治療后，小鼠脾臟指數(shù)減小，小鼠脾臟質(zhì)量顯著減低，脾細(xì)胞絕對計數(shù)、脾細(xì)胞相對計數(shù)顯著減少;環(huán)磷酰胺加五子衍宗方高、低劑量治療后小鼠脾臟指數(shù)降低;環(huán)磷酰胺加五子衍宗方高劑量組較環(huán)磷酰胺單獨(dú)治療小鼠脾臟質(zhì)量明顯降低，脾細(xì)胞絕對計數(shù)和相對數(shù)量明顯上升。其中相對計數(shù)為每克脾臟組織的淋巴細(xì)胞絕對數(shù)量。結(jié)果見表3。

3.4 對環(huán)磷酰胺化療荷瘤小鼠CD19+細(xì)胞的影響 環(huán)磷酰胺組CD19+細(xì)胞絕對數(shù)量與荷瘤對照組相比較其絕對數(shù)量銳減;與環(huán)磷酰胺單獨(dú)用藥相比較，環(huán)磷酰胺加五子衍宗方高、低劑量聯(lián)合治療組小鼠脾臟CD19+細(xì)胞絕對數(shù)量顯著上升。結(jié)果見表4。

表3 對環(huán)磷酰胺化療荷瘤小鼠脾細(xì)胞絕對數(shù)量及相對數(shù)量的影響(±s，n=10)

表3 對環(huán)磷酰胺化療荷瘤小鼠脾細(xì)胞絕對數(shù)量及相對數(shù)量的影響(±s，n=10)

注:與荷瘤對照組相比，#P＜0.05;##P＜0.01;與環(huán)磷酰胺組相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組 別 劑量/(g·kg－1) 脾臟質(zhì)量/g 脾臟指數(shù)/(mg·g－1)脾細(xì)胞絕對計數(shù)/(×107)脾細(xì)胞相對計數(shù)/(×107·g－1)荷瘤對照組 － 0.21±0.01＊＊ 9.08±0.48*9.49±1.13 45.86±4.45環(huán)磷酰胺組 0.05 0.12±0.05## 6.07±0.64# 3.82±0.37## 28.38±0.94#環(huán)磷酰胺+五子衍宗方組(低劑量) 0.05+0.42 0.11±0.01## 5.89±1.25# 4.56±0.36# 39.52±2.13#*環(huán)磷酰胺+五子衍宗方組(高劑量) 0.05+0.84 0.10±0.01##* 5.03±0.58# 5.36±0.46#* 50.57±10.22#*

表4 對環(huán)磷酰胺化療荷瘤小鼠CD19+細(xì)胞絕對數(shù)量的影響(±s，n=10)

表4 對環(huán)磷酰胺化療荷瘤小鼠CD19+細(xì)胞絕對數(shù)量的影響(±s，n=10)

注:與荷瘤對照組相比，##P＜0.01;與環(huán)磷酰胺組相比，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 劑量/(g·kg－1) CD19+絕對數(shù)量(×107)荷瘤對照組1972.78 ±128.69環(huán)磷酰胺組 0.05 417.75±223.53##－環(huán)磷酰胺+五子衍宗方組(低劑量) 0.05+0.42 421.87 ±55.12#＊＊環(huán)磷酰胺+五子衍宗方組(低劑量) 0.05+0.84 1348.83±447.73#*

3.5 對環(huán)磷酰胺化療荷瘤小鼠CD4+CD69+絕對數(shù)量、CD4+和CD8+絕對數(shù)量及CD4+/CD8+比例的影響 環(huán)磷酰胺治療組小鼠CD4+CD69+絕對數(shù)量較荷瘤對照組減少;小鼠CD4+T細(xì)胞絕對數(shù)量銳減，CD8+T細(xì)胞數(shù)量上升;CD4+/CD8+比例顯著降低;與環(huán)磷酰胺單獨(dú)治療組相比，環(huán)磷酰胺加五子衍宗方高、低劑量組小鼠CD4+CD69+絕對數(shù)量亦明顯增加;CD4+T和CD8+T細(xì)胞絕對數(shù)量顯著上升;CD4+/CD8+比例亦顯著回升。結(jié)果見表5。

4 討論

環(huán)磷酰胺是為最常用的烷化劑類抗腫瘤藥，在抑制腫瘤細(xì)胞生長與繁殖的同時，可導(dǎo)致骨髓抑制、免疫低下、生殖損害等毒副作用［3-4］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)五子衍宗方對環(huán)磷酰胺致免疫低下模型小鼠的免疫功能有明顯恢復(fù)作用，本研究中，我們聯(lián)合五子衍宗方和環(huán)磷酰胺對H22荷瘤小鼠進(jìn)行治療，觀察了五子衍宗方對環(huán)磷酰胺化療的減毒作用，并對其免疫學(xué)機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

表5 對H22荷瘤小鼠CD4+CD69+絕對數(shù)量、CD4+和CD8+絕對數(shù)量及CD4+/CD8+比例的影響 (±s，n=10)

表5 對H22荷瘤小鼠CD4+CD69+絕對數(shù)量、CD4+和CD8+絕對數(shù)量及CD4+/CD8+比例的影響 (±s，n=10)

注:與荷瘤對照組相比，#P＜0.05，##P＜0.01;與環(huán)磷酰胺組相比，*P＜0.05。

CD4/CD8荷瘤對照組 － 168.92±13.29 225.86±40.13 61.40±6.61 1.78組別 劑量/(g·kg －1)CD4+CD69+絕對數(shù)量(×107)CD4絕對數(shù)量(×107)CD8絕對數(shù)量(×107)±0.17環(huán)磷酰胺組 0.05 49.81±7.16## 104.20 ±9.52## 100.88±18.10# 1.11±0.14#環(huán)磷酰胺 +五子衍宗方組(低劑量)0.05+0.42 95.51±8.15##* 150.13 ±13.02#* 119.42±5.82# 1.56±0.11#*環(huán)磷酰胺 +五子衍宗方組(高劑量)0.05+0.84 56.24±11.40## 156.62 ±35.07#* 130.41±43.66# 1.96±0.31*#

脾臟是機(jī)體最大的外周免疫器官，其免疫細(xì)胞種類豐富，因此脾臟指數(shù)和淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)往往反映其外周免疫功能的強(qiáng)弱，尤其是脾臟淋巴細(xì)胞絕對值能夠反映實(shí)際免疫狀態(tài)［5-6］。在本實(shí)驗(yàn)中，與環(huán)磷酰胺單用組相比，五子衍宗方聯(lián)合環(huán)磷酰胺化療的小鼠脾臟指數(shù)和脾臟淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)明顯上升。CD4+/CD8+比例是腫瘤患者機(jī)體免疫狀態(tài)的指標(biāo)之一，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)五子衍宗方聯(lián)合用藥組的CD4+/CD8+比例顯著高于環(huán)磷酰胺組，提示五子衍宗方能夠拮抗環(huán)磷酰胺的免疫毒性，能較好恢復(fù)荷瘤機(jī)體的免疫力，有效改善免疫系統(tǒng)的基礎(chǔ)狀態(tài)，有利于發(fā)揮機(jī)體自身的抗腫瘤能力。

傳統(tǒng)化療藥物往往直接攻擊腫瘤細(xì)胞，同時損傷正常免疫細(xì)胞，如何同時激發(fā)機(jī)體自身的抗腫瘤免疫反應(yīng)引起越來越多關(guān)注。機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)十分復(fù)雜，一般以細(xì)胞免疫為主，其中CD4+T細(xì)胞的激活是發(fā)揮抗腫瘤免疫的前提條件之一［7］。CD4+T細(xì)胞激活后參與激活B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞，從而發(fā)揮協(xié)調(diào)抗瘤作用和直接殺瘤作用［5］。本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn):荷瘤小鼠脾臟保持一定數(shù)量的CD4+T細(xì)胞數(shù)量，經(jīng)環(huán)磷酰胺化療的小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞數(shù)量明顯下降;由于腫瘤抗原刺激，荷瘤小鼠有一定數(shù)量的CD4+T細(xì)胞表達(dá)CD69分子，而在同一時間點(diǎn)激活的CD4+T細(xì)胞在環(huán)磷酰胺治療組明顯下降，提示環(huán)磷酰胺可致荷瘤小鼠自身抗腫瘤免疫反應(yīng)受到抑制。相反地，五子衍宗方聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療荷瘤小鼠，出現(xiàn)CD4+T細(xì)胞數(shù)量上升，激活的CD4+CD69+T細(xì)胞數(shù)量明顯增加，提示五子衍宗方能有效促進(jìn)化療荷瘤小鼠體內(nèi)輔助性T細(xì)胞的活化并參與腫瘤免疫應(yīng)答。

B細(xì)胞數(shù)量銳減為環(huán)磷酰胺對免疫系統(tǒng)損害的突出特征［8］。本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酰胺可導(dǎo)致荷瘤小鼠B細(xì)胞數(shù)量銳減。五子衍宗方能夠顯著增加B細(xì)胞數(shù)量。提示五子衍宗方能拮抗環(huán)磷酰胺對免疫系統(tǒng)的損害，促進(jìn)機(jī)體自身抗腫瘤體液免疫應(yīng)答，因而抑瘤效果高于單用環(huán)磷酰胺。該現(xiàn)象也可能與五子衍宗方同時促進(jìn)體內(nèi)輔助性T細(xì)胞的大量活化繼而增強(qiáng)體液免疫有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

本研究提示五子衍宗方能夠明顯降低環(huán)磷酰胺的毒副作用，可通過增強(qiáng)機(jī)體自身抗腫瘤免疫效應(yīng)，從而改善環(huán)磷酰胺化療效果，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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