彭 琳 陳建良 方裕森 吳庫生 霍 霞

1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 汕頭 515031；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 汕頭 515041

乳腺癌作為女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率正呈逐年上升趨勢，在大城市的發(fā)病率甚至超過宮頸癌，躍居女性惡性腫瘤首位。1996～2003年，在我院惡性腫瘤住院病例前五位中，乳腺癌是唯一女性惡性腫瘤[1]，汕頭地區(qū)2005年的統(tǒng)計(jì)資料顯示，本地區(qū)已婚婦女乳腺癌檢出率是47.40/10萬[2]。乳腺癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中遺傳因素約占發(fā)病病因的1/4，基因遺傳變異和多態(tài)性被認(rèn)為是腫瘤易感性的重要分子基礎(chǔ)。

Prohibitin（PHB/PHB1）被認(rèn)為是一個候選腫瘤抑制基因，1992年日本Sato等首先提出該基因變異可能與散發(fā)性乳腺癌有關(guān)[3]。2001年一份北美人群的調(diào)查顯示，PHB基因rs6917 C＞T單核苷酸多態(tài)性 （single nucleotide polymophism，SNP）與乳腺癌遺傳易感性存在關(guān)聯(lián)[4]；然而隨后其他源自不同國家、不同種族的研究報(bào)道結(jié)論不盡一致。迄今為止，尚無中國漢族女性的相關(guān)報(bào)道[5]。本研究將采用高分辨率熔解曲線（HRM）技術(shù)進(jìn)行病例-對照研究，探討PHB rs6917位點(diǎn)SNP與潮汕女性乳腺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 對象

231例乳腺癌病例為2009年7～12月在我院住院診治的患者，均有病理確診報(bào)告，且排除同時合并宮頸癌、卵巢癌及其他惡性腫瘤。對照組169例為同期征集的健康體檢正常人群。所有對象要求均為潮汕籍漢族女性，無吸煙史。231例乳腺癌患者平均年齡（49.60±10.71）歲，169例正常對照組平均年齡為（49.06±14.19）歲，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.088）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在獲得知情同意后，采集乳腺癌患者及對照組人員2 mL外周血，以EDTA抗凝。采用TIANamp血液基因組DNA提取試劑盒 （天根生化科技有限公司）提取DNA。將提取好的DNA終濃度調(diào)節(jié)至10 ng/μL。PCR引物使用Lightscanner Primer Design Software設(shè)計(jì)，序列為5’-CCAGGAACGTAGGTCGGACAC-3’（上游）和 5’-GCTGAACATGCCTGCCAAAGA-3’（下游），由蘇州為真生物醫(yī)藥科技有限公司合成。Taq酶、dNTP購自Roche公司，熒光染料購自Biotium，96孔板、384孔板、封膜等購自漢爵克斯，使用LightCycler480實(shí)時熒光定量PCR儀（德國羅氏公司）。PCR反應(yīng)體系10 μL，含10×PCR Buffer（15 mmol/L MgCl2）1 μL，MgCl2（25 mmol/L）1 μL，dNTP（10 mmol/L）0.25 μL，20×Eva-green 飽和染料 0.5 μL，10 μm Primers各 0.25 μL，PCR 產(chǎn)物（10 ng/μL）1.0 μL、Taq 酶（5 U/μL）0.1 μL，ddH2O 5.65 μL。 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 5 min，95℃變性 10 s，60℃退火 15 s，72℃延伸 25 s，循環(huán)數(shù) 50。 擴(kuò)增結(jié)束后直接進(jìn)行 HRM，反應(yīng)條件：95℃ 1 min，40℃ 1 min，溶解曲線從65～95℃，溫度上升速率為0.02℃/s，每秒檢測熒光40次，最后40℃冷卻10 s。運(yùn)行Gene scanning程序，得到分型圖譜。對于多態(tài)性的基因分型結(jié)果，選取10%樣本進(jìn)一步測序驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增曲線及基因型分型圖見圖1、2。

圖1 PCR擴(kuò)增曲線

圖2 HRM分型圖

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間年齡比較采用 t檢驗(yàn)，Logistic回歸分析計(jì)算優(yōu)勢比（odds ratio，OR）及其 95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）。

2 結(jié)果

2.1 遺傳平衡檢驗(yàn)

對照組的rs6917 C＞T位點(diǎn)基因型經(jīng)過Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，P值符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（P=0.880），說明該人群基因型頻率處于平衡狀態(tài)，具有群體代表性。

2.2 PHB rs6916 C＞T位點(diǎn)基因型分布與乳腺癌易感性的關(guān)系

所有受檢對象均未發(fā)現(xiàn)TT基因型攜帶者。乳腺癌組C和T等位基因頻率分別為0.872和0.128，正常對照組C和T等位基因頻率分別為0.864和0.136。經(jīng)Logistic回歸分析，C/C基因型與T/C基因型攜帶者在乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.706）；在調(diào)整了年齡因素后，同樣未發(fā)現(xiàn)基因型與乳腺癌易感性有關(guān)聯(lián)（P=0.906），見表1。

3 討論

PHB基因定位于人染色體17q21，與已知的乳腺癌易感基因BRCA1相鄰。PHB具有增殖抑制作用，但與蛋白編碼區(qū)無關(guān)，而受控于該基因的3'-UTR。PHB基因的3’UTR存在一個功能性SNP——1630C/T（rs6917），當(dāng)該位點(diǎn)上的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏ぃ═）時，PHB失去增殖抑制作用，細(xì)胞永生化生長。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，UTR/C基因型能編碼功能性RNA，而UTR/T基因型編碼的RNA沒有活性，前者對腫瘤細(xì)胞增殖及移植瘤生長發(fā)揮顯著的抑制作用，可將細(xì)胞周期阻斷在G1/S[6]。

2001年，Jupe等[4]發(fā)表在LANCET的一篇報(bào)道首次關(guān)注PHB基因3'-UTR多態(tài)性與家族性、早發(fā)性乳腺癌的相關(guān)性。該研究通過對北美人群rs6917位點(diǎn)SNP分子流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，T等位基因型與具有一級親屬家族史的乳腺癌患者顯著相關(guān)（OR=2.5），同時，這種相關(guān)性在50歲前被診斷為乳腺癌人群中尤為明顯（OR=4.8）。然而隨后針對澳大利亞、英國及土耳其等人群的研究卻未能得出相同結(jié)論[7-9]。來自波蘭多中心研究的新近報(bào)道則指出，T等位基因型能增加BRCA1基因突變攜帶者罹患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)[10-11]。

中國漢族女性PHB基因rs6917位點(diǎn)的基因多態(tài)性是否也是乳腺癌的易感因素之一，目前并無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究首次利用高通量HRM-SNP技術(shù)對潮汕漢族女性PHB基因rs6917位點(diǎn)進(jìn)行基因多態(tài)性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本地區(qū)女性僅存在T/C和C/C兩種基因型，缺乏T/T基因型，T等位基因頻率低于可檢索到的其他種族人群T等位基因頻率為0.2的平均水平。由于病例組中僅發(fā)現(xiàn)4例有一級親屬罹患乳腺癌，故在本研究中未將該因素列入考慮。本次研究的數(shù)據(jù)表明，T/C和C/C兩種基因型在乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)度上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可見，PHB基因rs6917 C＞T多態(tài)性并非潮汕人群乳腺癌的易感因素之一。

事實(shí)上，PHB基因3'-UTR上還有若干SNP位點(diǎn)，包括rs1049620、rs4987083、rs9893420等，但目前針對乳腺癌易感性的研究多集中在rs6917這一位點(diǎn)上。筆者下一步的工作將對其他位點(diǎn)的基因多態(tài)性與乳腺癌相關(guān)性進(jìn)行篩選，翼以尋找可用于篩選乳腺癌易感個體的遺傳標(biāo)志物。

表1 PHB rs6917 T＞C多態(tài)性和乳腺癌發(fā)病危險(xiǎn)關(guān)系的Logistic回歸分析

[1]邱衛(wèi)黎，李澄婷，楊郁素，等.汕頭地區(qū)惡性腫瘤住院病例的疾病構(gòu)成及病死率分析[J].中華腫瘤防治雜志，2006，13（9）：645-647.

[2]陳敘，林群，姚春花，等.汕頭市區(qū)已婚女性乳腺疾病相關(guān)因素分析[J].廣東醫(yī)學(xué)，2005，26（6）：838-839.

[3]Sato T，Saito H，Swensen J，et al.The human prohibitin gene located on chromosome 17q21 is mutated in sporadic breast cancer [J].Cancer Res，1992，52： 1643-1646.

[4]Jupe ER，Badgett AA，Neas BR.Single nucleotide polymorphism in prohibitin 3'untranslated region and breast-cancer susceptibility[J].Lancet，2001，357： 1588-1589.

[5]彭琳，黃裔騰，許鎰洧，等.Prohibitin與乳腺癌[J].癌變·畸變·突變，2012，24（1）：75-77.

[6]ER Jupe，XT Liu，JL Kiehlbauch，et al.The 3’ untranslated region of prohibitin and cellular immortalization[J].Exp Cell Res，1996，224：128-135.

[7]Spurdle AB，Hopper JL，Chen X，et al.Prohibitin 3'untranslated region polymorphism and breast cancer risk in Australian women [J].Lancet，2002，360： 925-926.

[8]Campbell IG，Allen J，Eccles DM.Prohibitin 3 untranslated region polymorphism and breast cancer risk[J].Cancer Epidemiology Biomarkers&Prevention，2003，12：1273-1274.

[9]Karakus N，Kara N，Ulusoy AN.Lack of association between prohibitin 3′untranslated region C→T polymorphism and breast cancer in a turkish population[J].DNA Cell Biol，2008，27：449-452.

[10]Lubinski J，Scott RJ，Hamann U.The 3'untranslated region C>T polymorphism of prohibitin is a breast cancer risk modifier in Polish women carrying a BRCA1 mutation[J].Breast Cancer Res Treat，2007，104：67-74.

[11]Jakubowska A，Rozkrut D，Antoniou A，et al.Association of PHB 1630 C>T and MTHFR 677 C>T polymorphisms with breast and ovarian cancer risk in BRCA1/2 mutation carriers：results from a multicenter study[J].Br J Cancer，2012，106（12）：2016-2024.