楚廣民 張建波▲ 陳小兵▲ 劉紅亮

1.河南省腫瘤醫(yī)院 鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450008；2.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院老年科，河南 鄭州 450003

在真核生物代謝過程中，鳥氨酸脫羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）是控制多胺生成的限速酶，多胺則是調(diào)控細(xì)胞增殖的重要因子，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。在乳腺癌、肝癌等多種腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)ODC和多胺高表達(dá)，抑制ODC活性可使多胺生成減少，從而抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展[1-2]。本實驗通過RNA干擾技術(shù)抑制ODC在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株的表達(dá)，探討ODC在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa購自南京凱基生物科技有限公司細(xì)胞庫，置于含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中、5%CO2、37℃及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代 1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗。

1.2 主要試劑

DMEM-F12購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。小牛血清購自杭州四季青公司；ODC抗體、β-actin抗體均購于Santa Cruz Biotechnology公司。Lipofectamine TM2000脂質(zhì)體購于美國Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司。SYBR Green RT-PCR試劑盒購自北京天根生物技術(shù)有限公司。噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）和Trizol等試劑購自Sigma公司。DNA Marker購自天根生化科技有限公司；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。siRNA真核表達(dá)載體pSUPER-EGFP空質(zhì)粒由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室構(gòu)建惠贈。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

按照標(biāo)準(zhǔn)在6孔板進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。ODC siRNA的序列，F(xiàn)：CACCCGAAGTAGAGGAACATTCAAGAGATGTTCCTCTAC TTCGGGTG；R：GTGGGCTTCATCTCCTTGTAAGTTCTCTACAAGGAGATGAAGCCCAC。構(gòu)建了攜帶ODC siRNA的序列的真核表達(dá)載體pSUPER-EGFP-ODC。在無菌EP管內(nèi)加入質(zhì)粒4.0 μg，加入無雙抗無血清培養(yǎng)基至250 μL混勻，靜置5 min；另 lipofectamine TM2000脂質(zhì)體 10 μL，加入無雙抗無血清培養(yǎng)基至250 μL混勻，輕輕混合上述兩種溶液，室溫放置20 min備用。細(xì)胞棄去原培養(yǎng)基，用2 mL無血清的培養(yǎng)基孵育細(xì)胞2 h，棄去培養(yǎng)液加入上述溶液，將培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5 h后去除轉(zhuǎn)染混合液，更換為普通全培基。實驗分三組：Ishikawa組，pSUPER-EGFP組，pSUPEREGFP-ODC組。Ishikawa為未轉(zhuǎn)染細(xì)胞；pSUPER-EGFP為轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞；pSUPER-EGFP-ODC為轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒細(xì)胞。

1.4 Real-time PCR檢測ODC mRNA表達(dá)

收集各組細(xì)胞，用Trizol提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒上的步驟反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。ODC上游引物為TGGCTTCCAGAGGCCGACGA，下游引物為GACACAGGCAGGGTGCTGGC，擴(kuò)增片段長度為126 bp；內(nèi)參為β-actin，上游引物為GCCCTGGCACCCAGCACAAT，下游引物為GGAGGGGCCGGACTCGTCAT，擴(kuò)增片段長度為150 bp。PCR 擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性 10 min，94℃變性 30 s，褪火 30 s，71℃延伸 30 s，40 個循環(huán)；融解曲線階段：95℃ 15 s，56℃ 30 s，95℃ 15 s。 ODC mRNA 表達(dá)水平采用 2-△△Ct法評估。

1.5 Western blot檢測ODC蛋白表達(dá)

選取各組處于對數(shù)生長期的細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白。取20 μL蛋白和 8 μL Loading在 6%濃縮膠和 12%分離膠SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST液室溫封閉2 h，然后加入1∶500稀釋的羊抗人ODC多抗和1∶400稀釋的抗β-actin抗體室溫震蕩培育4 h，TBST液充分洗滌 5次，每次10 min。 加入1∶1000稀釋的羊抗鼠IgG二抗，室溫震蕩培育4 h，TBST液充分洗滌3次，每次10 min。暗室中顯色、曝光、顯影和成像。

1.6 MTT測定細(xì)胞增殖能力

取處于對數(shù)生長期的各組Ishikawa細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，以（1～2）×105個/mL的細(xì)胞密度接種于96孔板中，每組設(shè)5復(fù)孔。細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下孵育，使之貼壁，依次分別培養(yǎng) 1、2、3、4、5、6 d。 結(jié)束培養(yǎng)前每孔加入 5 mg/mL 的 MTT 溶液 20 μL，繼續(xù)在前述條件下培養(yǎng) 4 h，加入 DMSO 150 μL。 震蕩10 min使紫藍(lán)色結(jié)晶物充分融解。用酶標(biāo)儀（Bio2rad 680）于570 nm波長測定每孔的吸光度（absorbance）。以各實驗孔吸光度值減去空白對照孔吸光度值得出其A值來反映存活細(xì)胞數(shù)量，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡情況

用0.25%胰蛋白酶適度消化收集處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，每組至少收集細(xì)胞數(shù)1×106個細(xì)胞，輕輕吹打制備單細(xì)胞懸液細(xì)胞后移入新的1.5 mL離心管中，4℃，500 g，離心5 min。小心移去上清液并用冰預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次。上流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期和凋亡數(shù)據(jù)并進(jìn)行資料分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SAS 6.12和SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t檢驗，MTT結(jié)果采用兩因素方差分析，其余結(jié)果采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ODC mRNA和蛋白的檢測

PCR和Western Blotting結(jié)果示pSUPER-EGFP-ODC組ODC mRNA和蛋白的表達(dá)水平與Ishikawa和pSUPEREGFP比較，明顯降低，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），Ishikawa和pSUPER-EGFP比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P>0.05）（圖 1、2）。

圖1 ODC mRNA在三組Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá)情況

圖2 ODC蛋白在三組Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.2 pSUPER-EGFP-ODC對Ishikawa細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示pSUPER-EGFP-ODC組Ishikawa細(xì)胞生長能力與Ishikawa和pSUPER-EGFP比較，明顯降低，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），Ishikawa和pSUPER-EGFP比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖3。

圖3 pSUPER-EGFP-ODC對Ishikawa細(xì)胞增殖的影響

2.3 pSUPER-EGFP-ODC對Ishikawa細(xì)胞周期和凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示ODC沉默后能阻滯Ishikawa細(xì)胞于期 G0/G1期pSUPER-EGFP-ODC組細(xì)胞百分比 （66.22±3.33）%與 pSUPER-EGFP 組的 （53.83±4.51）%和 Ishikawa組的（50.25±3.48）%比較，明顯增高，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（F=14.523，P<0.01）；S 期細(xì)胞百分比pSUPER-EGFP-ODC組的（19.98±3.54）% 與 pSUPER-EGFP 組 的 （34.51±2.37）% 和Ishikawa組的（37.1±2.91）%比較，明顯降低，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（F=28.778，P<0.01）。ODC 沉默后能誘導(dǎo) Ishikawa組細(xì)胞 凋 亡 ，pSUPER-EGFP-ODC組 細(xì) 胞 凋 亡 率 [（13.86±3.07）%]與 pSUPER-EGFP 組的（2.31±1.09）%和Ishikawa組的（2.17±0.99）%比較，明顯增高，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（F=34.866，P<0.01）（圖 4、5）。

圖4 pSUPER-EGFP-ODC對Ishikawa細(xì)胞周期的影響

圖5 pSUPER-EGFP-ODC對Ishikawa細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是一種原發(fā)于子宮內(nèi)膜的惡性腫瘤，是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計近幾年來發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈增高趨勢[3]。目前子宮內(nèi)膜癌的主要治療手段是早期以手術(shù)治療為主輔以放療、化療等手段，晚期患者則主要以手術(shù)縮瘤、術(shù)后輔助放療、化療及激素治療，但療效差，生存期短?；蛑委煶蔀榻陙碜訉m內(nèi)膜癌研究熱點之一。ODC作為多胺合成的限速酶，能催化鳥氨酸生成腐胺，后者再生成精脒和精胺[4]。研究發(fā)現(xiàn)ODC基因及其酶活性在多種腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織中均呈顯著增高狀態(tài)，且ODC的高表達(dá)是疾病不良預(yù)后的指標(biāo)[5-7]。有研究報道[8-9]，ODC的抑制劑二氟甲基鳥氨酸（DFMO）能有效抑制結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長，但由于該藥毒副作用大，限制了其在臨床中的應(yīng)用。因此有必要探討以O(shè)DC為靶點新的抗腫瘤治療策略，其中RNA干擾技術(shù)是研究方向之一。

本研究以子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa為研究對象，以O(shè)DC為腫瘤治療靶點，用RNA干擾技術(shù)特異性地下調(diào)ODC基因的表達(dá)，探討ODC表達(dá)下降對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa的影響。本研究首先成功沉默了子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞ODC的表達(dá)，同時設(shè)pSUPER-EGFP轉(zhuǎn)染組和親本Ishikawa細(xì)胞作為對照。為證明ODC的沉默效果，筆者分別用realtime PCR和Western blot方法檢測ODC mRNA和蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示pSUPER-EGFP-ODC的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均明顯下降。說明本實驗的脂質(zhì)體介導(dǎo)的RNA沉默序列可以有效地下調(diào)ODC基因表達(dá)。這與其他學(xué)者以往報道的結(jié)果相符合，如Moussavi等[10]證實用病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾可以在前列腺癌細(xì)胞LNCaP，C4-2，DU145 and PC-3下調(diào)ODC基因的表達(dá)。為進(jìn)一步證實ODC基因表達(dá)下調(diào)后對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa的影響，筆者分別用MTT和流式細(xì)胞術(shù)來測定細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞周期和凋亡情況。本研究結(jié)果顯示，pSUPER-EGFP-ODC細(xì)胞與pSUPER-EGFP轉(zhuǎn)染組和親本Ishikawa細(xì)胞相比ODC基因沉默的細(xì)胞的增殖活性明顯受到抑制，細(xì)胞阻滯于G0/G1期，S期細(xì)胞數(shù)相應(yīng)減少，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

總之，本實驗用RNA干擾技術(shù)引起ODC基因沉默并抑制了子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa的生長，這是ODC基因沉默抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長的有力證據(jù)，為ODC基因應(yīng)用于子宮內(nèi)膜癌的基因治療提供了實驗依據(jù)。

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