吳 志 張仁劍 閆 明 李永海

遼寧省人民醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧 沈陽 110016

丙泊酚注射液為O/W型靜脈乳劑，屬于烷基酚類靜脈麻醉藥，具有作用時(shí)間短、麻醉誘導(dǎo)起效快、蘇醒迅速而完全、持續(xù)輸注后無蓄積、副作用少等特點(diǎn)[1-2]，臨床上廣泛用于全身麻醉的誘導(dǎo)、維持及ICU鎮(zhèn)靜[3]。目前法定的熱原檢查方法有家兔熱原檢查法和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。以前多用家兔法，但該法存在操作繁瑣、靈敏度低、重復(fù)性差、費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn)，而細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法操作簡單，靈敏度高，干擾少，速度快?？梢娪眉?xì)菌內(nèi)毒素檢查法替代家兔熱原檢查法是一種趨勢。筆者未檢索到有關(guān)丙泊酚注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的報(bào)道，因此參照《中國藥典》2010年版二部附錄收載的“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”和相關(guān)文獻(xiàn)[4-10]，通過試驗(yàn)研究，考察建立丙泊酚注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的可行性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

恒溫水浴（重慶試驗(yàn)設(shè)備廠）、XW-80A旋渦混合器（上海醫(yī)大儀器廠），試驗(yàn)所用玻璃器皿均在250℃烘烤2 h，以去除可能存在的外源性細(xì)菌內(nèi)毒素。

1.2 試藥

鱟試劑（TAL，湛江博康海洋生物有限公司，0.1 mg/支，靈敏度0.25 EU/mL，批號：0702280；湛江安度斯生物有限公司，靈敏度0.25 EU/mL，批號：0807022）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE，中國藥品生物制品檢定所，規(guī)格：160EU/支，批號：150601-200862）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，湛江博康海洋生物有限公司，2 mL/支，批號：090323）；丙泊酚注射液（商品名：得普利麻，規(guī)格：20 mL∶200mg，批號：GD280、GD953、GE746）。

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核

根據(jù)鱟試劑標(biāo)示靈敏度（λ）為0.25 EU/mL，用細(xì)菌內(nèi)毒檢查用水溶解細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，在旋渦混合器上混勻15 min，然后制成 0.5000、0.2500、0.1250、0.0625 EU/mL 4個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30 s，取2個(gè)批號復(fù)溶后的0.1 mL/支的鱟試劑原安瓿18支，其中16管分別加入0.1 mL不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)內(nèi)毒素濃度平行做4管；另外2管加入0.1 mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入（37±1）℃的恒溫器中，保溫（60±2）min。對兩批鱟試劑進(jìn)行靈敏度復(fù)核。見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果

結(jié)果顯示，兩批鱟試劑經(jīng)復(fù)核，靈敏度均在0.5λ～2.0λ之間，符合規(guī)定，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

根據(jù)公式L=K／M確定供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值。其中，L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，K為人每公斤體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射液的 K=5 EU／（kg·h），M 為人用每公斤體重每小時(shí)的最大供試品劑量。人均體重按60 kg計(jì)算。丙泊酚注射液在臨床上用于全麻維持時(shí)的用量最大，通常成人每小時(shí)9～15 mg/kg的給藥速率。則M=15 mg，L=0.33 EU/mg。但考慮到藥品使用安全性要求，將本品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值定為0.3 EU/mg。

2.3 最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確定

根椐公式MVD=CL/λ計(jì)算。C為供試品溶液的濃度，為10 mg/mL，由“2.2”項(xiàng)下分析可知，L=0.3 EU/mg。 考慮到市售的鱟試劑靈敏度多在0.5000～0.1250 EU/mL之間，因此丙泊酚注射液的 MVD0.5000～0.0625為 6～24 倍。

2.4 干擾預(yù)試驗(yàn)

取一批丙泊酚注射液做干擾預(yù)試驗(yàn)。用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將丙泊酚注射液進(jìn)行逐級稀釋，制得原液、3、6、12、24倍的系列稀釋液，作為供試品陰性對照 （NPC）。另配制與NPC相同濃度梯度的供試品溶液，每個(gè)濃度添加等體積細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，制得每個(gè)濃度均含2λ細(xì)菌內(nèi)毒素的系列溶液，作為供試品陽性對照（PPC）。每個(gè)濃度平行做兩管，同時(shí)作陽性對照（PC）、陰性對照（NC）。分別取2個(gè)廠家的，靈敏度0.25 EU/mL的鱟試劑進(jìn)行試驗(yàn)。見表2。

表2 丙泊酚注射液干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

由表2結(jié)果可知，丙泊酚注射液稀釋12倍或以上倍數(shù)，可消除對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的干擾。

2.5 干擾試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇兩個(gè)廠家、λ為0.25 EU/mL的鱟試劑、丙泊酚注射液12倍稀釋液作為供試品溶液，進(jìn)行干擾試驗(yàn)。用供試品溶液及BET水分別將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成含 2.00λ、1.00λ、0.50λ、0.25λ 的溶液，每一濃度平行做4管，另取BET水和供試品溶液分別作陰性對照、供試品陰性對照，各平行做兩管。按鱟試劑靈敏度度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。見表3。

表3 丙泊酚注射液干擾試驗(yàn)結(jié)果

由表3的結(jié)果可知，用BET水和供試品溶液作陰性對照管、供試品陰性對照管，結(jié)果均為陰性，兩組鱟試劑的Es為 0.25 EU/mL， 在 0.5λ～2.0λ 之間；Et在 0.5Es～2.0Es之間（Es為BET水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度幾何平均值；Et為供試品溶液制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度幾何平均值），試驗(yàn)有效，說明丙泊酚注射液經(jīng)12倍稀釋對鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素之間凝集反應(yīng)既無抑制作用，也無增強(qiáng)現(xiàn)象。

2.6 丙泊酚注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

取3批丙泊酚注射液，使用λ=0.25 EU/mL的鱟試劑，參考《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪE依法檢查。見表4。

表4 丙泊酚注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

由表4可知，NC和NPC均為陰性；PPC和PC均為陽性，試驗(yàn)有效。結(jié)果表明，3批樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均符合規(guī)定。

3 討論

干擾預(yù)試驗(yàn)是為了確定不出現(xiàn)干擾的第1個(gè)樣品稀釋度，初步選出對檢查無干擾的樣品稀釋倍數(shù)范圍及相應(yīng)的鱟試劑靈敏度，減少后續(xù)試驗(yàn)的盲目性。本試驗(yàn)沒有選以市售鱟試劑靈敏度計(jì)算所得的MVD作為起始濃度，是為了更好地探索其干擾程度，故選用原液作為起始濃度。結(jié)果顯示，6倍稀釋液的供試品陽性對照均部分出現(xiàn)陽性，12倍稀釋液的供試品陽性均為陽性，因此，可確定不出現(xiàn)干擾的第1個(gè)樣品稀釋度為丙泊酚注射液的12倍稀釋液。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法具有操作簡單、迅速且靈敏度高的特點(diǎn)。但它的試驗(yàn)結(jié)果會受到鱟試劑、生產(chǎn)工藝、處方配比、試驗(yàn)環(huán)境或供試品稀釋方式等多種因素的影響而發(fā)生變化，不同廠家的相同品種對其細(xì)菌內(nèi)毒素檢查所產(chǎn)生的干擾情況也存在較大的差別，因此，進(jìn)行干擾試驗(yàn)是很有必要的。

不同廠家的鱟試劑在生產(chǎn)工藝、抗干擾能力等方面存在差異。因此，本研究采用兩個(gè)不同廠家的、靈敏度0.25 EU/mL的鱟試劑，對3批丙泊酚注射液進(jìn)行試驗(yàn)。從干擾試驗(yàn)可知，稀釋12倍的丙泊酚注射液溶液對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查沒有干擾，此方法是可行的。

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