盧賢貴，唐 斌，何 芳，張 強，黃 剛，王 剛，鄒放君，鄧峰美3，△

(1石河子大學醫(yī)學院病理生理學教研室，新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，新疆 石河子 832002;2石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832008;3成都醫(yī)學院病理學教研室，四川 成都 610083)

原發(fā)性高血壓(essential hypertension，EH)是遺傳和環(huán)境共同作用的復(fù)雜性疾病，其中遺傳因素起著重要作用。而內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)由于其對血壓調(diào)節(jié)的重要作用而倍受重視。目前國內(nèi)外已有許多研究發(fā)現(xiàn)eNOS基因多態(tài)性與高血壓有密切關(guān)系［1－2］，有研究報道［3］eNOS基因rs7830和rs3918188位點多態(tài)性與青光眼有關(guān)，但與EH的相關(guān)性目前尚未見報道。本研究選取eNOS rs7830和rs3918188兩個位點，運用流行病學及分子遺傳學手段，探討新疆哈薩克族eNOS基因多態(tài)性分布特征，闡明其連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)模式及單倍型分布特征，揭示新疆哈薩克族EH的分子遺傳易感機制。

材料和方法

1 研究對象

樣本來源于2007年11月～2009年5月期間在新疆天山北麓塔城地區(qū)沙灣縣博爾通古鄉(xiāng)的哈薩克族人群，采取整群隨機抽樣，抽取高血壓患者363例，其中男156例，女207例，年齡18～65歲，健康對照組370例，其中男153例，女217例，年齡18～60歲。原發(fā)性高血壓入選按照1999年世界衛(wèi)生組織頒布的高血壓病診斷標準，排除繼發(fā)性高血壓、心肌病、心肌梗死、瓣膜性心臟病、先天性心臟病、過量飲酒、甲狀腺疾病、肝腎功能不全、糖尿病、孕婦、哺乳期及口服避孕藥婦女等。對照組納入標準:查體健康者，收縮壓＜140 mmHg和舒張壓＜90 mmHg，無服用降壓藥史、高血壓家族史及其它器質(zhì)性心臟病史等。調(diào)查對象符合醫(yī)學倫理學要求。所有研究對象均非一、二級親屬，無血緣關(guān)系，無異族通婚史。

2 調(diào)查內(nèi)容

采用統(tǒng)一的調(diào)查表以一對一的形式進行調(diào)查研究，測量身高、體重、腰圍和臀圍，計算體重指數(shù)［body mass index，BMI= 體重(kg)/身高2(m2)］和腰臀比［waist－to－h(huán)ip ratio，WHR= 腰圍(cm)/臀圍(cm)］等。臨床檢測血糖、血脂(甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白)等生化指標。

3 方法

3.1 基因組DNA提取 實驗前夜禁食12 h以上。次晨抽取空腹血液標本10 mL，用肝素和 EDTA抗凝管，分離血樣，血漿當天做生化檢測。血液用酚－氯仿法進行DNA抽提。

3.2 eNOS基因目的片段擴增 設(shè)計PCR引物用于擴增包含單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點的片段，緊鄰SNP位點的延伸引物用于單堿基延伸。檢索美國國立生物技術(shù)信息中心公共數(shù)據(jù)庫中SNP位點序列，用Premier 5.0軟件設(shè)計PCR引物及延伸引物，其由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。rs7830的PCR引物序列:5'－GGCTGCATGACATTGAGAGCAA －3'和5'－GTGGACTTTGTTTCCTGCCCTCT－3'，單堿基延伸引物序列:5'－ 27T+CCCTTCAGGCAGTCCTTTAGTC － 3'。rs3918188的 PCR引物序列:5'－CAAGTGGGGATTCAGCAACTCC－3'和5'－GTGGTCTGGGAACAGGTGCTCT－3'，單堿基延伸引物序列:5'－26T+CAAGGCACACGTACAAGGG－3'。PCR體系:10×buffer 2 μL，25 mmol/L MgCl21.2 μL，dNTP 0.6 μL，多重 PCR 引物 2 μL，Hotstar Taq 聚合酶 0.2 μL，DNA 模板 1 μL，去離子水 13 μL，總體系 20 μL。循環(huán)程序:95℃ 15 min;94℃ 20 s，65℃ 40 s(每個循環(huán)下降0.5℃)，72℃ 1.5 min，11個循環(huán);94℃20 s，59℃ 30 s，72℃ 1.5 min，24個循環(huán);72℃ 2 min;結(jié)束后4℃保存。PCR產(chǎn)物單堿基延伸反應(yīng)體系(10 μL):5 μL SNaPshot Multiplex Kit(ABI)，2 μL純化后PCR產(chǎn)物，1 μL延伸引物(包含0.8 μmol/L rs7830SF 以及 1.6 μmol/L rs3918188SF)，2 μL 超純水。循環(huán)程序:96℃ 1 min;96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃ 30 s，28個循環(huán);60℃ 1 min;4℃保存。

3.3 eNOS基因PCR產(chǎn)物測序及多態(tài)位點的分型首先取10 μL延伸產(chǎn)物并向其中加入1 U SAP酶，37℃溫浴1 h，然后75℃滅活15 min，來進行延伸產(chǎn)物的純化。然后取0.5 μL純化后的延伸產(chǎn)物，與0.5 μL 120 LIZ Size Standard，9 μL Hi－ Di混勻，95℃變性5 min后上ABI 3130XL測序儀，原始數(shù)據(jù)用片段分析和基因分型分析軟件GeneMapper 4.0(Applied Biosystems)來分析。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。按Hardy－Weinberg平衡法檢測樣本的群體代表性。計量資料用均數(shù)±標準差()表示，兩組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗;Logistic回歸分析排除年齡、體重指數(shù)等混雜因素對EH的影響;單倍型采用Phase 2.1軟件構(gòu)建;連鎖不平衡分析采用Data Analyser 0.34軟件構(gòu)建。

結(jié) 果

1 新疆哈薩克族EH組與正常對照組臨床相關(guān)指標的比較

新疆天山北麓塔城地區(qū)沙灣縣博爾通古鄉(xiāng)牧區(qū)哈薩克族牧民的EH檢出率為49.5%，其平均收縮壓為(134.8±27.0)mmHg，平均舒張壓為(88.0±16.3)mmHg。年齡、收縮壓、舒張壓、平均動脈壓、脈壓、體重指數(shù)、腰臀比、膽固醇、低密度脂蛋白、空腹血糖、甘油三酯、肌酐、尿酸和載脂蛋白A1/B在EH組和正常對照組間比較均有差異(P＜0.01或P＜0.05);而載脂蛋白A1、載脂蛋白B和高密度脂蛋白在2組間均無顯著差異(P＞0.05)，見表1。

表1 新疆哈薩克族EH組與正常對照組臨床相關(guān)指標比較Table 1.Comparison of clinical characteristics between essential hypertension(EH)and control subjects in the Kazakh population of Xinjiang()

表1 新疆哈薩克族EH組與正常對照組臨床相關(guān)指標比較Table 1.Comparison of clinical characteristics between essential hypertension(EH)and control subjects in the Kazakh population of Xinjiang()

△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01 vs control group.

Age(year) 49.64 ±12.05△△1.84 ±0.6038.46 ±11.91 SBP(mmHg) 154.82 ±23.41△△ 115.29 ±11.80 DBP(mmHg) 100.27 ±13.43△△ 76.11 ±7.58 MAP(mmHg) 118.45 ±15.26△△ 89.17 ±8.03 PP(mmHg) 54.55 ±17.76△△ 39.18 ±9.56 BMI(kg/m2) 27.38 ±4.82△△ 23.99 ±4.11 WHR 0.89 ±0.96△△ 0.87 ±0.08 FBG(mmol/L) 5.62 ±1.09△ 5.43 ±1.29 TC(mmol/L) 5.01 ±1.37△△ 4.65 ±1.30 TG(mmol/L) 1.63 ±5.53△ 0.96 ±1.01 LDL －C(mmol/L) 3.23 ±1.06△△ 2.99 ±1.18 HDL －C(mmol/L) 1.44 ±0.43 1.46 ±0.41 CR(μmol/L) 73.85 ±25.09△△ 68.07 ±24.47 UA(μmol/L) 248.26 ±85.38△△ 231.15 ±68.87 ApoA1(g/L) 1.47 ±0.38 1.44 ±0.32 ApoB(g/L) 1.16 ±4.32 0.83 ±0.26 ApoA1/B(g/L) 1.69 ±0.66△△

2 新疆哈薩克族eNOS基因rs7830和rs3918188位點基因型和等位基因頻率分析

eNOS基因rs7830和rs3918188位點在EH組、對照組及總?cè)巳旱幕蛐秃偷任换蚍植季螲ardy－Weinberg平衡，提示該人群有較好的代表性。這2個位點的基因型和等位基因頻率在2組的分布差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 新疆哈薩克族高血壓組與對照組eNOS基因rs7830和rs3918188位點基因型及等位基因頻率的比較Table 2.Comparison of genotypic distribution and allele frequencies of rs7830 and rs3918188 of eNOS gene between EH and control subjects in the Kazakh population of Xinjiang

3 新疆哈薩克族EH相關(guān)影響因素的Logistic回歸分析

將可能影響血壓水平的因素包括年齡、體重指數(shù)、腰臀比、生化指標及兩位點等因素引入Logistic回歸分析，結(jié)果顯示年齡、體重指數(shù)、甘油三酯、低密度脂蛋白和載脂蛋白A1/B是新疆哈薩克族EH相關(guān)的影響因素(P＜0.01或P＜0.05)。其中年齡(β=0.073)、體重指數(shù)(β=0.148)和甘油三酯(β=0.251)是EH發(fā)生的危險因素，而低密度脂蛋白(β=－0.307)和載脂蛋白A1/B(β=－0.366)是EH發(fā)生的保護因素。在控制了年齡、體重指數(shù)、腰臀比、膽固醇、低密度脂蛋白、空腹血糖、甘油三酯、肌酐、尿酸、載脂蛋白 A1/B等混雜因素后，未發(fā)現(xiàn)rs7830和rs3918188位點多態(tài)性與EH相關(guān)(P＞0.05)，見表 3。

4 新疆哈薩克族eNOS基因rs7830和rs3918188位點的連鎖不平衡分析

采用Data Analyzer 0.34軟件分析，當D'＞0.8且r2＞0.8時認為2個位點間存在連鎖不平衡。結(jié)果顯示 D'=0.856且 r2=0.182，提示 eNOS基因rs7830和rs3918188位點在新疆哈薩克族中均不存在連鎖不平衡，圖1、表4。

5 新疆哈薩克族eNOS基因rs7830和rs3918188位點的單倍型分析

Phase 2.1軟件構(gòu)建4種單倍型，它們分別為CA、CC、AC和AA，結(jié)果顯示這4種單倍型頻率在2組的分布差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表5。

表3 新疆哈薩克族EH相關(guān)影響因素的Logistic回歸分析Table 3.Logistic regression analysis of influential factors of essential hypertension in the Kazakh population of Xinjiang

Figure 1.Linkage disequilibrium structure chart of eNOS gene rs7830 and rs3918188 among Kazakh in Xinjiang.r2:correlation coefficient;D':linkage disequilibrium coefficient;LD:linkage disequilibrium.圖1 新疆哈薩克族eNOS基因rs7830和rs3918188位點間連鎖不平衡結(jié)構(gòu)圖

表4 新疆哈薩克族eNOS基因rs7830和rs3918188多態(tài)位點的連鎖不平衡分析Table 4.Linkage disequilibrium analysis ofrs7830 and rs3918188 of eNOS gene in the Kazakh population of Xinjiang

表5 新疆哈薩克族eNOS基因rs7830和rs3918188位點的單倍型分布Table 5.Haplotype distribution of eNOS gene rs7830 and rs3918188 in the Kazakh population of Xinjiang

討 論

目前EH病因尚未闡明，但其發(fā)病具有遺傳傾向。EH的基因表達在很大程度上受環(huán)境因素影響。許多研究顯示人群超重和肥胖與血壓升高有關(guān)［4－5］，超重和肥胖是高血壓的危險因素。哈薩克族是新疆第二大少數(shù)民族，其高血壓發(fā)病率居全國前五位［6］。該民族高血壓的發(fā)生有獨特的環(huán)境和遺傳背景。當?shù)厝巳簶O少與外界通婚，從地理位置及血緣上為相對獨立群體，有較大的遺傳同源性，同時影響血壓的環(huán)境因素較一致，是從遺傳和環(huán)境因素兩個方面探討EH的較為理想的人群。本研究選取新疆天山北麓塔城地區(qū)哈薩克族作為研究對象。研究結(jié)果顯示年齡、體重指數(shù)、腰臀比、膽固醇、低密度脂蛋白、空腹血糖、甘油三酯、肌酐、尿酸和載脂蛋白A1/B是新疆哈薩克族EH相關(guān)的影響因素。進一步多因素Logistic回歸分析，在控制了年齡、體重指數(shù)、腰臀比等混雜因素后，年齡、體重指數(shù)、甘油三酯、低密度脂蛋白和載脂蛋白A1/B是新疆哈薩克族EH相關(guān)的影響因素。根據(jù)回歸系數(shù)，年齡、體重指數(shù)和甘油三酯是EH發(fā)生的危險因素，而低密度脂蛋白和載脂蛋白A1/B是EH發(fā)生的保護因素。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新疆哈薩克族人群超重和肥胖是EH的危險因素，上述情況可能與有其獨特的飲食習慣等因素有關(guān)。新疆哈薩克族世代居住牧區(qū)及山區(qū)，由于冬季時間長，缺乏戶外鍛煉，交通閉塞，缺乏新鮮蔬菜攝入，而動物脂肪和鹽攝入較多，與Deng等［7］的報道一致，提示新疆哈薩克族隨著年齡增高，超重或肥胖，高甘油三酯、低載脂蛋白A1/B和低低密度脂蛋白，患EH的風險增高。已有報道年齡增大和血脂異常是動脈粥樣硬化等心血管疾病的危險因素之一［8－11］，本研究結(jié)果進一步證實了年齡增大、超重、肥胖及血脂代謝紊亂與EH有密切的關(guān)系。

在人類基因組有3種不同的基因編碼NOS，分別為eNOS基因、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)基因。在3種NOS基因中，eNOS基因是高血壓的重要候選基因。目前國內(nèi)外對eNOS基因 rs3918188和rs7830位點多態(tài)性與心血管疾病的相關(guān)研究較少。Kullo等［12］對659名非西班牙裔白人的研究中發(fā)現(xiàn)eNOS基因rs7830位點多態(tài)性與外周動脈血管疾病踝肱指數(shù)(ankle － brachial index，ABI)相關(guān)。張陽東等［13］對107例冠心病患者和132名健康對照組對比研究中發(fā)現(xiàn)eNOS基因rs7830多態(tài)性變異及由rs7830和rs3918188構(gòu)建的CA和AA單倍型是冠心病的遺傳危險因素。本課題組前期對eNOS基因rs3918188和rs7830位點多態(tài)性與新疆漢族EH的相關(guān)性已有報道［14］。但在新疆哈薩克族尚未見報道。本研究顯示在新疆哈薩克族eNOS基因rs7830和rs3918188位點共檢出3種基因型(CC、CA、AA)和2個等位基因(C、A)。2組基因型和等位基因頻率分布均無差異。eNOS基因rs7830和rs3918188位點多態(tài)性與新疆哈薩克族EH不相關(guān)?？刂屏四挲g、體重指數(shù)、腰臀比等混雜因素進一步做多因素Logistic回歸分析，2個多態(tài)位點與EH不相關(guān)。連鎖不平衡分析顯示這2個位點不存在連鎖不平衡。單倍型分析發(fā)現(xiàn)，在該人群中存在4種單倍型(CA、CC、AC和AA)，但均與EH不相關(guān)。而與鄒放君等［14］對新疆漢族與EH相關(guān)性研究結(jié)果不一致，新疆漢族與EH相關(guān)。說明研究對象的種族差異會影響到與疾病的相關(guān)性，進一步說明了遺傳因素對EH發(fā)生的影響。

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