楊思思，姜 騰，張木勛

(華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北 武漢 430030)

隨著生活水平提高和生活方式改變，肥胖已成為世界范圍的多發(fā)病，它是非傳染性疾病的重要危險(xiǎn)因素之一［1］。阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，嚴(yán)重?fù)p害患者的認(rèn)知功能，造成患者自理能力障礙及精神行為異常。流行病學(xué)研究顯示，肥胖是AD的獨(dú)立危險(xiǎn)因子［2］。AD最典型的病理改變是:淀粉樣β肽(amyloid β －peptide，Aβ)沉積導(dǎo)致的老年斑及微管相關(guān)蛋白tau過(guò)度磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié)，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Aβ沉積是AD始發(fā)病理生理學(xué)改變，可導(dǎo)致tau蛋白過(guò)度磷酸化［3－5］。研究顯示肥胖人群海馬內(nèi)Aβ沉積較正常人群出現(xiàn)得早且重［6］，具體機(jī)制仍不清楚，有學(xué)者認(rèn)為與肥胖時(shí)機(jī)體處于慢性炎癥狀態(tài)有關(guān)。肥胖時(shí)機(jī)體呈現(xiàn)由炎癥因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的全身性慢性低度炎癥狀態(tài)，研究表明TNF－α表達(dá)增加可引起Aβ沉積［7－9］。胰島素降解酶 (insulindegrading enzyme，IDE)是體內(nèi)降解Aβ的重要酶之一，胰島素及Aβ均是其作用底物，兩者可競(jìng)爭(zhēng)性與其結(jié)合。IDE表達(dá)減少可使Aβ降解減少?gòu)亩练e［5］。另外，IDE表達(dá)可能受過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator－activated receptor γ，PPARγ)調(diào)控［10］。本實(shí)驗(yàn)旨在研究肥胖時(shí) TNF －α、PPARγ及IDE表達(dá)，從而探討肥胖時(shí)海馬內(nèi) Aβ沉積增多的機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物模型

雄性SD大鼠(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供)，體重180～220 g，10～12周齡。隨機(jī)將大鼠分為對(duì)照組(control，CTL組)與肥胖組(obesity，OB組)。CTL組予正常飲食、OB組予高脂高糖高蛋白飲食(熱卡百分比為碳水化合物26.0%，蛋白質(zhì)15.2%，脂肪58.8%)飼養(yǎng)12周。大鼠肥胖判斷標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)高糖高脂高蛋白飼料喂養(yǎng)，大鼠體重超過(guò)普通飼料喂養(yǎng)的20%作為OB組。成模后斷頸處死所有老鼠，快速斷頭冰上操作取雙側(cè)海馬，一側(cè)分為兩半，分別放入2個(gè)滅菌離心管中(分別用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting);另一側(cè)置于4%多聚甲醛中固定(用于免疫組織化學(xué)染色)。

2 觀察指標(biāo)及方法

2.1 一般指標(biāo)測(cè)定 (1)血糖(plasma glucose)測(cè)定:處死前由尾靜脈采血，用血糖儀(強(qiáng)生穩(wěn)豪)檢測(cè)血糖水平。(2)血漿胰島素(plasma insulin)測(cè)定:處死前心臟取血1 mL，離心后取血漿，－20℃保存，放射免疫法一次性檢測(cè)。藥盒購(gòu)自北京原子能研究所。(3)胰島素抵抗指標(biāo)計(jì)算:穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA－IR)=空腹胰島素(fasting plasma insulin，mIU/L)×空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG，mmol/L)/22.5［11］。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)海馬內(nèi)TNF－α、淀粉樣 β 蛋白前體(amyloid β －protein precursor，APP)、PPARγ及IDE mRNA水平 用Trizol法提取各組織總RNA，測(cè)定樣品中260 nm和280 nm吸收峰的A值，鑒定RNA純度和含量。逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng):按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟制備cDNA;20 μL體系，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上樣;反應(yīng)條件95℃ 3 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，重復(fù)40 個(gè)循環(huán)。由熔解曲線(xiàn)判定PCR反應(yīng)的特異性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)以及熒光曲線(xiàn)的Ct值計(jì)算定量結(jié)果。通過(guò)2－ΔΔCt計(jì)算各指標(biāo)的表達(dá)，ΔCt=Ct目的基因－ Ct內(nèi)參照，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組－ΔCt模型對(duì)照組，cDNA 表達(dá)差別倍數(shù)以 2－ΔΔCt表示。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

2.3 Western blotting檢測(cè)大鼠海馬 TNF － α、Aβ42、PPARγ及IDE蛋白水平 取海馬放入勻漿器內(nèi)，加入蛋白質(zhì)提取液，冰上勻漿(總蛋白質(zhì)提取液購(gòu)自武漢凌飛科技公司)。于4℃、12000×g離心10 min，取上清即為蛋白質(zhì)。取10 μL用Bradford法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，余儲(chǔ)存于－80℃?zhèn)溆?。用前?×樣本緩沖液并混勻，于100℃變性5 min。在具10道雙垂直電泳槽孔內(nèi)加入約12 μg蛋白質(zhì)，10%SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)，結(jié)束轉(zhuǎn)至PVDF膜。搖床上5%的脫脂奶粉中封閉，37℃ 1 h;雜交Ⅰ抗［Aβ42(Epitomics)、IDE(Epitomics)、PPAR γ (Santa Cruz)和TNF－α(Abcam)］4℃過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10 min;雜交Ⅱ抗(辣根酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠IgG，購(gòu)自Santa Cruz)，室溫?fù)u床上1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL試劑盒顯色(ECL試劑盒購(gòu)于武漢凌飛科技公司)。運(yùn)用Quantity One凝膠吸光度分析軟件對(duì)免疫反應(yīng)條帶進(jìn)行定量分析。

2.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠海馬中TNF－α、Aβ42、PPARγ及IDE組織表達(dá) 海馬經(jīng)4%多聚甲醛中固定48 h后，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制作冠狀石蠟切片，按照免疫組織化學(xué)染色步驟:烘片、脫蠟至水、抗原修復(fù)、血清封閉、加Ⅰ抗、加Ⅱ抗、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、分化、封片、照相。用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(Olympus)隨機(jī)選擇5個(gè)視野內(nèi)的陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域進(jìn)行圖像掃描分析，得到平均吸光度值，平均吸光度越大，表示相關(guān)的抗原表達(dá)越強(qiáng)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 11.5數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。各組均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 兩組大鼠體重、血糖、胰島素及胰島素抵抗程度的比較

表2顯示OB組及MET組血糖較CTL組無(wú)明顯差異;OB組體重上升高于20%，血漿胰島素水平及胰島素抵抗程度均高于CTL組(P＜0.01，P＜0.05)，說(shuō)明高糖高脂高蛋白飲食造肥胖大鼠模型成功。

表2 動(dòng)物分組及一般資料Table 2.Design of experimental rats and laboratory data(.n=10)

表2 動(dòng)物分組及一般資料Table 2.Design of experimental rats and laboratory data(.n=10)

CTL:control;OB:obesity.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs CTL.

Group Diet Weight(g)Plasma glucose(mmol/L) Plasma insulin(U/L)HOMA－IR CTL Normal 300.2 ±16.8 6.72 ±0.32 7.48 ±0.46 2.85 ±0.76 OB High glucose，high fat and high protein 416.3 ±14.8* 9.54 ±2.10 19.10 ±4.86＊＊ 6.38 ±2.01*

2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大鼠海馬內(nèi)TNF－α、APP、PPARγ及IDE的mRNA表達(dá)水平

圖1顯示，OB組大鼠海馬內(nèi)APP和TNF－α mRNA水平較CTL組升高，PPARγ和IDE mRNA表達(dá)下降。

Figure 1.Expression of TNF － α，APP，PPARγ and IDE mRNA in rat hippocampi analyzed by real－time fluorescence quantitative PCR.CTL:control group;OB:obesity group..n=10.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs CTL.圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大鼠海馬內(nèi)的APP、TNF－α、PPARγ及IDE mRNA表達(dá)水平

3 運(yùn)用免疫印跡檢測(cè)兩組大鼠海馬內(nèi)TNF－α、Aβ42、PPARγ和 IDE 水平

圖2顯示，與CTL組比較，OB組海馬內(nèi)TNF－α及Aβ42表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05)，PPARγ及 IDE表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)。

Figure 2.Western blotting analysis of TNF － α，Aβ42，PPARγ and IDE in rat hippocampi.CTL:control group;OB:obesity group..n=10.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs CTL.圖2 免疫印跡檢測(cè)大鼠海馬內(nèi) TNF－α、Aβ42、PPARγ及IDE水平

4 運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)2組大鼠海馬內(nèi)各指標(biāo)

圖3顯示OB組較CTL組海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)TNF－α和Aβ42表達(dá)增加，PPARγ和IDE表達(dá)減少。陽(yáng)性表達(dá)鏡下觀察呈褐色改變。

Figure 3.Immunohistochemical staining of TNF－α，Aβ42，PPARγ and IDE in rat hippocampi(×400).CTL:control group;OB:obesity group..n=10.*P＜0.05 vs CTL.圖3 免疫組化技術(shù)檢測(cè)兩組大鼠海馬內(nèi)TNF－α、Aβ42、PPARγ及IDE的表達(dá)

討 論

肥胖常伴有胰島素抵抗及慢性炎癥反應(yīng)，研究證明后者是導(dǎo)致肥胖胰島素抵抗的關(guān)鍵原因［12］。肥胖時(shí)外周炎癥因子水平升高，其中TNF－α是主要的致炎因子，可影響胰島素受體和胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1，IRS1)的酪氨酸磷酸化并導(dǎo)致IRS1的泛素化及降解，降低蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)的活癥導(dǎo)致胰島素抵抗。研究顯示肥胖時(shí)海馬內(nèi)Aβ沉積與胰島素抵抗相關(guān)，深入研究證實(shí)炎癥因子在兩者的關(guān)系中起到重要作用［2，13－14］。Aβ 沉積是 AD 患者最典型的病理生理改變，正常情況下Aβ的產(chǎn)生和降解是平衡的，當(dāng)此平衡被打破就會(huì)引起Aβ異常沉積，目前認(rèn)為Aβ清除減少是打破此平衡的關(guān)鍵點(diǎn)［14］。沉積的Aβ可使Tau蛋白磷酸化，兩者導(dǎo)致斑塊形成、神經(jīng)原纖維纏積，最終引起 AD 的發(fā)生［3－5］。Aβ 由其前體蛋白APP經(jīng)酶水解生成有病理意義的Aβ40和Aβ42，其中Aβ42易聚集，具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性［2，14］。IDE 是一種含鋅的金屬肽酶，在Aβ42降解中起到重要作用。有研究證實(shí)IDE功能缺陷可導(dǎo)致腦中Aβ降解障礙，而IDE過(guò)度表達(dá)可降低Aβ水平、延遲或完全預(yù)防腦中淀粉樣斑塊的形成［5］。IDE 表達(dá)受 PPARγ 調(diào)控［10］，下調(diào)PPARγ可使IDE轉(zhuǎn)錄減少，從而水平下降。研究發(fā)現(xiàn)外周炎癥反應(yīng)，炎癥介質(zhì)TNF－α刺激可以引起PPARγ下降;另外，已證實(shí)PPARγ配體具有抗炎效應(yīng)［5］，激活 PPARγ可減輕炎癥反應(yīng)，炎癥因子表達(dá)減少。那么，肥胖時(shí)Aβ增加，除了因胰島素水平增加競(jìng)爭(zhēng)性抑制Aβ與IDE結(jié)合降低其降解Aβ的作用外，是否與炎癥因子下調(diào)PPARγ表達(dá)，從而降低IDE基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)呢?

本研究我們檢測(cè)了肥胖大鼠海馬內(nèi)炎癥因子TNF－α mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示肥胖組海馬TNF－α mRNA表達(dá)較正常組顯著上升，這與前人研究結(jié)果一致。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步檢測(cè)大鼠海馬內(nèi)Aβ42及IDE表達(dá)，結(jié)果顯示肥胖組 Aβ42水平上調(diào)、IDE下降。IDE作為Aβ42的降解酶，兩者呈負(fù)相關(guān)。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們還觀察到肥胖時(shí)大鼠海馬內(nèi)隨著TNF－α表達(dá)上調(diào)，PPARγ表達(dá)是下降的，這提示炎癥因子TNF－α可能下調(diào)PPARγ表達(dá);另外，PCR結(jié)果顯示肥胖組IDE mRNA水平下降，表明肥胖時(shí)IDE轉(zhuǎn)錄減少，且此時(shí)PPARγ表達(dá)亦下降。由上述結(jié)果我們可推測(cè)，肥胖時(shí)腦內(nèi)Aβ沉積增加的機(jī)制可能為:肥胖時(shí)機(jī)體處于慢性炎癥狀態(tài)，大腦也不例外，其中炎癥因子TNF－α表達(dá)上調(diào);這使得神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)PPARγ表達(dá)減少，IDE表達(dá)下調(diào)，Aβ42沉積增加。IDE作為降解Aβ42的關(guān)鍵酶，其表達(dá)下調(diào)可直接致使Aβ42沉積增加。

［1］Hatch EE，Nelson JW，Stahlhut RW，et al.Association of endocrine disruptors and obesity:perspectives from epidemiological studies［J］.Int J Androl，2010，33(2):324 －332.

［2］Lee YH，Martin RL，Maple WG，et al.Plasma amyloid －β peptide levels correlate with adipocyte amyloid precursor protein gene expression in obese individuals［J］.Neuroendocrinology，2009，90(4):383 －390.

［3］Chouliaras L，Rutten BP，Kenis G，et al.Epigenetic regulation in the pathophysiology of Alzheimer’s disease［J］.Prog Neurobiol，2010，90(4):498 －510.

［4］Lesné S，Koh MT，Kotilinek L，et al.A specific amyloid －β protein assembly in the brain impairs memory［J］.Nature，2006，440(7802):352 －357.

［5］Crews L，Masliah E.Molecular mechanisms of neurodegeneration in Alzheimer’s disease［J］.Hum Mol Genet，2010，19(R1):R12 － R20.

［6］Findeis MA.The role of amyloid β peptide 42 in Alzheimer’s disease［J］.Pharmacol Ther，2007，116(2):266 －286.

［7］Craft S.Insulin resistance syndrome and Alzheimer’s disease.Age－ and obesity－related effects on memory amyloid and inflammation［J］.Neurobiol Aging，2005，26(1):65－69.

［8］Malm T，Koistinaho M，Muona A，et al.The role and therapeutic potential of monocytic cells in Alzheimer’s disease［J］.Glia，2010，58(8):889 －900.

［9］Azzu V，Jastroch M，Divakaruni AS，et al.The regulation and turnover of mitochondrial uncoupling proteins［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1797(6 －7):785 －791.

［10］Espuny －Camacho I，Dominguez D，Merchiers P，et al.Peroxisome proliferator－activated receptor gamma enhances the activity of an insulin degrading enzyme－like metalloprotease for amyloid － β clearance［J］.J Alzheimers Dis，2010，20(4):1119－1132.

［11］Matthews DR，Hosker JP，Rudenski AS，et al.Homeostasis model assessment:insulin resistance and β－cell function from fasting plasma glucose and insulin concentrations in man［J］.Diabetologia，1985，28(7):412 －419.

［12］Jiao P，Ma J，F(xiàn)eng B，et al.FFA －induced adipocyte inflammation and insulin resistance:involvement of ER stress and IKKβ pathways［J］.Obesity，2011，19(3):483－491.

［13］Monteiro R，Azevedo I.Chronic inflammation in obesity and the metabolic syndrome［J］.Mediators Inflamm，2010，2010:289645.

［14］Vassar R.β － Secretase，APP and Aβ in Alzheimer’s disease［J］.Subcell Biochem，2005，38:79 －103.