李姝玉， 柴新樓， 吳 瑩， 賈德賢， 郝 鈺， 蘇瑋蓮， 王 謙△

(1北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京100029;2天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見而難治的微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因之一。在DN 發(fā)病過程中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGF－β1)起著關(guān)鍵的作用，可以促進(jìn)糖尿病腎小球纖維化和間質(zhì)纖維化過程的發(fā)生、發(fā)展。而骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetic protein 7，BMP－7)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性腎臟保護(hù)因子，具有抗纖維化的作用，能夠拮抗TGF－β1的作用。黃芪和葛根是治療DN 的常用中藥，能有效改善腎臟功能，然而，其作用機(jī)制尚缺乏充分了解。因此，本研究觀察黃芪注射液聯(lián)合葛根素注射液對(duì)2 型糖尿病腎病模型KKAy小鼠腎臟TGF－β1和BMP－7 表達(dá)的影響，探討黃芪注射液和葛根素注射液治療DN 的有關(guān)作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

SPF 級(jí)KKAy小鼠40 只，雄性，9 ～11 周齡，25 ～28 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK(京)2005－0013，隨機(jī)血糖≥13.9mol/L，確定為糖尿病小鼠。C57BL/6J 小鼠18 只，雄性，9 ～11周齡，23 ～25 g，許可證號(hào)為SCXK(京)2003－0003，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物自由飲水，KKAy小鼠給予高脂飼料(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供)，C57BL/6J 小鼠給予生長(zhǎng)維持顆粒飼料(購(gòu)自北京科奧協(xié)力飼料有限公司)，以上動(dòng)物均飼養(yǎng)在中日友好醫(yī)院臨床研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)。

2 藥物與試劑

黃芪注射液購(gòu)自成都地奧九泓制藥廠，規(guī)格為每毫升含生藥2 g，產(chǎn)品批號(hào)為0608056。葛根素注射液購(gòu)自浙江康恩貝制藥股份有限公司，規(guī)格為每毫升含葛根素50 mg，產(chǎn)品批號(hào)為0601013。TGF－β1兔抗多克隆抗體和DAB 顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 及高敏過氧化物復(fù)合酶購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。Trizol 購(gòu)自Invitrogen，RT－PCR有關(guān)試劑購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司;引物由賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，TGF－β1上游引物序列5'－TCCCTCAACCTCAAATTATTCA－3'，下游引物序列5'－GCGGTCCACCATTAGCAC－3'，擴(kuò)增后片段長(zhǎng)度為493 bp;BMP－7 上游引物序列5'－GACGCCAAAGAACCACAAGAG－3'，下游引物序列5'－TCACAGTAGTAGGCAGCATAGC－3'，擴(kuò)增后片段長(zhǎng)度為165 bp;β－actin 上游引物序列5'－GAAATCGTGCGTGACATTAAGG－3'，下游引物序列5'－CACGTCACACTTCATGATGGAG－3'，擴(kuò)增后片段長(zhǎng)度為243 bp。

3 主要儀器

Freestyle 利舒坦血糖儀，日立7600P 全自動(dòng)生化分析儀，Eppendorf RT－PCR 儀，紫外分光光度計(jì)，凝膠成像儀。

4 方法

4.1 動(dòng)物分組及給藥方法 KKAy小鼠飼養(yǎng)至14周齡時(shí)，將其按照隨機(jī)血糖分組:模型組(model group，MG)20 只;治療組(treatment group，TRG)20只，每日腹腔注射黃芪注射液(3 mL·kg－1·d－1)和葛根素注射液(1.3 mL·kg－1·d－1)，2 種藥物先后給藥。18 只C57BL/6J 小鼠作為正常組(normal group，NG)。實(shí)驗(yàn)期間，各組動(dòng)物自由飲食、飲水。分別于20 周齡、24 周齡和28 周齡處死動(dòng)物。

4.2 小鼠一般狀態(tài)及體重變化 每天觀察小鼠一般狀態(tài)，隔周稱量各組小鼠體重。

4.3 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 剪尾檢測(cè)20 周齡、24 周齡和28 周齡各組小鼠空腹血糖(blood glucose，BG)。20 周齡小鼠禁食12 ～14 h 后，處死動(dòng)物，眼球取血，分離血清，日本日立7600P 全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清甘油三酯(triglyceride，TG)、膽固醇(cholesterol，TC)及血肌酐(serum creatinine，SCr)。24 周齡和28 周齡小鼠指標(biāo)檢測(cè)方法同上。

4.4 免疫組織化學(xué)染色 將石蠟包埋的腎組織制成4 μm 厚的切片，用SABC 法檢測(cè)腎組織TGF－β1的蛋白表達(dá)情況。以PBS 代替Ⅰ抗作為陰性對(duì)照。每張切片隨機(jī)選取6 個(gè)高倍視野，每組選取6 張切片，Olympus 公司圖像采集系統(tǒng)采集圖像，Image－Pro Plus 5.1 圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析。

4.5 RT－PCR 檢測(cè)腎組織TGF－β1和BMP－7 mRNA 表達(dá) 按照Trizol 說明書提取腎組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA 質(zhì)量與濃度。每組分別取5 μg 先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后分別取4 μL 反應(yīng)產(chǎn)物，進(jìn)行多聚酶鏈(PCR)反應(yīng)，TGFβ1、BMP－7 和β－actin 的退火溫度均為50 ℃，95℃5 min，95 ℃30 s，50 ℃30 s，72 ℃40 s，擴(kuò)增36輪。PCR 產(chǎn)物的電泳分析:取10 μL 產(chǎn)物，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳后于紫外燈下根據(jù)PCR marker 位置判斷目標(biāo)產(chǎn)物，拍照后進(jìn)行灰度掃描，分別計(jì)算TGF－β1和BMP－7 擴(kuò)增產(chǎn)物的吸光度值與β－actin 擴(kuò)增產(chǎn)物的吸光度值的比值作為表達(dá)水平參數(shù)，進(jìn)行半定量分析。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 一般狀態(tài)及體重變化情況

模型組小鼠有精神不振，活動(dòng)遲緩，尿量明顯增多，體毛缺乏光澤，而且隨著周齡增加癥狀加重。治療組以上情況得到不同程度的改善。模型組28 周齡小鼠有1 只死亡。模型組小鼠各時(shí)點(diǎn)體重均比正常組增長(zhǎng)明顯，差異顯著(P ＜0.01)。治療組小鼠20、24 周齡體重均比正常組增長(zhǎng)明顯，差異顯著(P＜0.01);與模型組相比，治療組20 ～28 周小鼠體重增長(zhǎng)減緩，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05 或P ＜0.01)，見表1。

表1 各組小鼠體重檢測(cè)結(jié)果Table 1. Body weight of mice in each group (g. ±s)

表1 各組小鼠體重檢測(cè)結(jié)果Table 1. Body weight of mice in each group (g. ±s)

＊＊P ＜0.01 vs NG;▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01 vs MG. NG:normal group;MG:model group;TRG:treatment group.

Group 20 weeks 24 weeks 28 weeks NG 25.68 ±4.49(n=6) 30.17 ±1.94(n=6) 32.83 ±3.66 (n=6)MG 41.42 ±2.53＊＊(n=6) 45.13 ±2.09＊＊(n=6) 43.28 ±3.65＊＊(n=7)TRG 36.47 ±3.23＊＊▲(n=6) 39.93 ±3.31＊＊▲▲(n=6) 35.87 ±4.91▲▲(n=8)

2 血清生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

從20 周齡開始，模型組及治療組小鼠血糖比正常組高，差異顯著(P ＜0.01)，治療組小鼠空腹血糖較模型組降低，差異顯著(P ＜0.05 或P ＜0.01)，見表2。模型組SCr 自24 周齡開始明顯升高，與正常組相比差異顯著(P ＜0.01);治療組小鼠24 及28 周齡時(shí)SCr 水平較模型組明顯降低(P ＜0.01)，并且28 周齡時(shí)高于正常組(P ＜0.05)，見表2。模型組自20 周齡開始，TG 和TC 明顯升高，與正常組小鼠相比差異顯著(P ＜0.01);20 和28 周齡時(shí)治療組小鼠TG 較模型組有所降低，24 周齡時(shí)，治療組小鼠TC 較模型組明顯降低(P ＜0.01)，見表3。

表2 各組小鼠血糖及血清肌酐檢測(cè)結(jié)果Table 2. Blood glucose (BG)and serum creatinine (SCr)of mice in various groups (±s)

表2 各組小鼠血糖及血清肌酐檢測(cè)結(jié)果Table 2. Blood glucose (BG)and serum creatinine (SCr)of mice in various groups (±s)

* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs NG;▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01 vs MG.

Group BG(mmol/L)SCr(μmol/L)20 weeks 24 weeks 28 weeks 20 weeks 24 weeks 28 weeks NG 5.21±0.95 (n=6) 4.25±1.28(n=6) 3.54±1.06(n=6) 10.05±1.13(n=6) 6.21±2.00(n=6) 9.42±2.60(n=6)MG 22.50±2.69＊＊(n=6) 20.85±5.86＊＊(n= 6) 12.54±2.36＊＊(n=7) 9.45±1.41(n=6) 12.08±1.14＊＊(n=6) 19.17±3.38＊＊(n=7)TRG 13.68±3.15＊＊▲▲(n= 6)14.83±3.21＊＊▲(n=6) 7.00±1.51＊＊▲▲(n=8) 10.10±1.12(n=6) 7.70±0.90▲▲(n=6) 13.36±3.07＊▲▲(n=8)

表3 各組小鼠甘油三酯和膽固醇檢測(cè)結(jié)果Table 3. Serum triglyceride (TG)and cholesterol (TC)of mice in various groups (mmol/L. ±s)

表3 各組小鼠甘油三酯和膽固醇檢測(cè)結(jié)果Table 3. Serum triglyceride (TG)and cholesterol (TC)of mice in various groups (mmol/L. ±s)

＊＊P ＜0.01 vs NG;▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01 vs MG.

Group TG TC 20 weeks 24 weeks 28 weeks 20 weeks 24 weeks 28 weeks NG 0.15±0.03(n=6) 0.64±0.06(n=6) 0.65±0.24 (n=6) 2.53±0.23(n=6) 2.04±0.24(n=6) 2.10±0.34(n=6)MG 0.25±0.02＊＊(n=6) 2.20±0.44＊＊(n=6) 1.68±0.60＊＊(n=7) 5.21±1.17＊＊(n=6) 6.48±0.50＊＊(n=6) 6.18±1.73＊＊(n=7)TRG 0.19±0.05▲▲(n=6) 1.79±0.48＊＊(n=6) 1.13±0.48▲(n=8) 5.13±0.85(n=6) 3.86±1.00＊＊▲▲(n=6) 5.43±0.90＊＊(n=8)

3 免疫組化染色結(jié)果

正常組腎小球系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞胞漿中均有較弱的TGF－β1表達(dá)，見圖1A;模型組與正常組比較，腎小管上皮細(xì)胞胞漿中TGF－β1強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，腎小球內(nèi)也可見表達(dá)，但不如腎小管上皮細(xì)胞胞漿表達(dá)明顯，且其表達(dá)隨周齡增長(zhǎng)而增多，見圖1B。治療組小鼠TGF－β1在腎小球和腎小管的表達(dá)均較模型組明顯降低，差異顯著(P ＜0.01)，見圖1C、表4。

4 RT－PCR 檢測(cè)TGF－β1和BMP－7 mRNA 的表達(dá)

各周齡模型組小鼠腎臟TGF－β1mRNA 表達(dá)均比正常組小鼠高，治療組小鼠TGF－β1mRNA 表達(dá)比模型組低，差異顯著(P ＜0.05);各周齡模型組小鼠腎臟BMP－7 mRNA 表達(dá)均比正常組小鼠低，20和24 周齡治療組小鼠BMP－7 mRNA 表達(dá)比模型組高，差異顯著(P ＜0.05)，28 周齡治療組與模型組無(wú)顯著差異，見圖2、表5。

Figure 1. Expression of TGF－β1 in renal tissues from each group at the end of 24 weeks (immunohistochemical staining， × 400). A:normal group;B:model group;C:treatment group.圖1 24 周齡各組小鼠腎組織TGF－β1 免疫組化染色

表4 各組小鼠腎臟TGF－β1 的免疫組化圖像分析結(jié)果Table 4. Immunohistochemical image analysis results of TGF－β1 expression in the kidney of mice in various groups (±s.n=6)

表4 各組小鼠腎臟TGF－β1 的免疫組化圖像分析結(jié)果Table 4. Immunohistochemical image analysis results of TGF－β1 expression in the kidney of mice in various groups (±s.n=6)

＊＊P ＜0.01 vs NG;▲▲P ＜0.01 vs MG.

Group 20 weeks 24 weeks 28 weeks NG 20 475.72 ±5 204.95 21 363.45 ±5 111.88 22 598.90 ±5 381.02 MG 94 385.10 ±16 695.46＊＊ 142 483.97 ±7 149.30＊＊ 192 384.28 ±6 480.86＊＊TRG 28 405.74 ±11 981.22▲▲ 70 242.29 ±7 839.27＊＊▲▲ 63 171.88 ±5 075.73＊＊▲▲

Figure 2. TGF－β1 and BMP－7 mRNA expression in renal tissues from each group at the end of 24 weeks. M:marker;NG:normal group;MG:model group;TRG:treatment group.圖2 24 周齡各組小鼠腎組織TGF－β1 和BMP－7 mRNA 表達(dá)情況

表5 各組小鼠腎臟BMP－7 和TGF－β1 的RT－PCR 圖像分析結(jié)果Table 5. Image analysis results examined by RT－PCR of BMP－7 and TGF－β1 in the kidney of mice in various group (±s.n=5)

* P ＜0.05 vs NG;▲P ＜0.05 vs MG.

Group BMP－7 TGF－β 1 20 weeks 24 weeks 28 weeks 20 weeks 24 weeks 28 weeks NG 1.57 ±0.09 1.55 ±0.27 1.65 ±0.61 0.33 ±0.05 0.34 ±0.02 0.35 ±0.01 MG 0.84 ±0.26* 0.86 ±0.33* 0.87 ±0.37* 0.53 ±0.05* 0.59 ±0.06* 0.53 ±0.07*TRG 1.11 ±0.47＊▲ 1.23 ±0.20▲ 0.97 ±0.35* 0.37 ±0.03▲ 0.39 ±0.05▲ 0.37 ±0.02▲

討 論

黃芪注射液為傳統(tǒng)中藥黃芪提取物的滅菌水溶液(10 mL 相當(dāng)于生藥材20 g)，主要成分為黃芪多糖、黃酮、黃芪皂苷等，具有益氣養(yǎng)元，扶正祛邪，養(yǎng)心通脈的功效。臨床研究證實(shí)黃芪注射液能降糖調(diào)脂，改善糖尿病腎病患者的腎功能［1］。葛根素注射液為傳統(tǒng)中藥葛根提取物的滅菌水溶液，主要成分為葛根素，為由豆科植物野葛干燥根中提出的一種黃酮苷，其亦為臨床證明有效的單味中藥提取物，實(shí)驗(yàn)研究有明顯的降血糖作用［2］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠出現(xiàn)精神不振，活動(dòng)遲緩，尿量明顯增多，體毛缺乏光澤等癥狀，而且隨著周齡增加癥狀加重。治療組小鼠以上情況得到不同程度的改善。模型組和治療組各時(shí)點(diǎn)體重均比正常組增長(zhǎng)明顯，但是與模型組相比，治療組20 ～28 周小鼠體重增長(zhǎng)減緩。糖尿病模型組小鼠血糖、TG、TC 和SCr 較正常組升高，治療組上述指標(biāo)仍高于正常組，但較模型組明顯下降，尤其是在治療早期，下降更為明顯，提示黃芪注射液聯(lián)用葛根素注射液有降血糖、降血脂、保護(hù)腎功能的作用。

DN 是糖尿病慢性并發(fā)癥，在糖尿病早期尚無(wú)腎功損害時(shí)，腎臟內(nèi)環(huán)境及超微結(jié)構(gòu)已經(jīng)出現(xiàn)改變。DN 早期病理改變?yōu)槟I小球體積擴(kuò)大、基底膜增厚、系膜基質(zhì)增生，晚期為腎小球和腎間質(zhì)纖維化，病變本質(zhì)是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成與降解失衡，ECM 過度積聚和沉積。其中由腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)而來的肌成纖維細(xì)胞(MFB)能合成大量ECM。很多因素參與促進(jìn)ECM 的沉積，TGF－β1的作用受到廣泛關(guān)注［3］。TGF－β1在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，包括:促進(jìn)ECM 成分如Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型膠原和多種蛋白多糖的合成;抑制ECM 的降解;促進(jìn)整合素的表達(dá)而增強(qiáng)細(xì)胞與基質(zhì)的作用;促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化等［4－5］。

機(jī)體內(nèi)還存在一種天然拮抗TGF－β1的因子，即BMP－7。它可促進(jìn)胚胎期腎臟發(fā)育過程中間充質(zhì)細(xì)胞向上皮細(xì)胞的分化，是胚胎腎臟發(fā)育分化及生長(zhǎng)不可缺少的重要因子，在成年哺乳動(dòng)物腎臟中會(huì)持續(xù)高度表達(dá)。Gould 等［6］證實(shí)在腎臟損傷修復(fù)的過程中，BMP－7 高表達(dá)，根據(jù)其及其受體在腎臟獨(dú)特的表達(dá)及分布方式推測(cè)，它可能具有保護(hù)腎臟、防御損傷的作用。現(xiàn)已證實(shí):BMP－7 可以通過影響TGF－β1/Smad 信號(hào)通路阻斷腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化進(jìn)程，發(fā)揮抗纖維化作用［7］。DN 動(dòng)物模型中，腎臟BMP－7 及其受體的表達(dá)明顯下降，下降幅度與腎纖維化的程度平行［8］，給予外源性BMP－7 治療能明顯延緩DN 的進(jìn)程，部分逆轉(zhuǎn)腎小球肥大，改善腎功能［9］。

我們的免疫組化結(jié)果顯示，模型組小鼠與正常組比較，腎小管上皮細(xì)胞胞漿中TGF－β1強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，腎小球內(nèi)也可見表達(dá)，但不如腎小管上皮細(xì)胞胞漿表達(dá)明顯，且其表達(dá)隨周齡增長(zhǎng)而增多。治療組小鼠腎組織TGF－β1蛋白表達(dá)均較模型組明顯降低，差異顯著。RT－PCR 結(jié)果顯示，模型組小鼠腎臟TGF－β1mRNA 表達(dá)比正常組小鼠高，治療組小鼠TGF－β1mRNA 表達(dá)比模型組表達(dá)降低;模型組小鼠腎臟BMP－7 mRNA 表達(dá)比正常組小鼠低，20周齡和24 周齡治療組小鼠BMP－7 mRNA 表達(dá)比模型組高。這表明黃芪注射液聯(lián)合葛根素注射液對(duì)2型糖尿病腎病模型KKAy小鼠的腎臟保護(hù)作用可能是部分通過抑制DN 腎臟中TGF－β1的表達(dá)，并通過增加腎臟組織BMP－7 的表達(dá)從而拮抗TGF－ β1的致纖維化作用來實(shí)現(xiàn)的。本研究為黃芪注射液聯(lián)用葛根素注射液治療DN 提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］ 劉儀紅，田浩明.黃芪治療糖尿病腎病的系統(tǒng)評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)循證醫(yī)學(xué)雜志，2007，7(10):715－727.

［2］ 歷淑芬，劉海清，從曉東. 葛根素注射液的藥理作用研究進(jìn)展［J］. 黑龍江醫(yī)藥，2010，23(4):587－589.

［3］ Song Y，Li C，Cai L. Fluvastatin prevents nephropathy likely through suppression of connective tissue growth factor mediated extracellular matrix accumulation［J］. Exp Mol Pathol，2004，76(1):66－75.

［4］ Docherty NG，Osullivan OE，Healy DA，et al. TGF－β1－induced EMT can occur independently of its proapoptotic effects and is aided by EGF receptor activation［J］. Am J Physiol Renal Physiol，2006，290(5):F1202－F1212.

［5］ Lin H，Wang D，Wu T，et al. Blocking core fucosylation of TGF－ β1receptors downregulates their functions and attenuates the epithelial－mesenchymal transition of renal tubular cells［J］. Am J Physiol Renal Physiol，2011，300(4):F1017－F1025.

［6］ Gould SE，Day M，Jones SS，et al. BMP－7 regulates chemokine，cytokine，and hemodynamic gene expression in proximal tubule cells［J］. Kidney Int，2002，61(1):51－60.

［7］ Bechtel W，Zisberg M. Bone morphogenic protein－7 and the kidneys:insights into the future management of chronic kidney diseases［J］. Dtsch Med Wochenschr，2009，134(34－35):1688－1691.

［8］ Wang SN，Lapage J，Hirschberg R. Loss of tubular bone morphogenetic protein－7 in diabetic nephropathy［J］. J Am Soc Nephrol，2001，12(11):2392－2399.

［9］ Wang S，Caestecker M，Kopp J，et a1. Renal bone morphogenetie protein－7 protects against diabetic nephropathy［J］. J Am Soc Nephrol，2006，17(9):2504－2512.