李 祥，金愛(ài)慧，鄒立林，高基民，呂建新

(溫州醫(yī)學(xué)院浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省模式生物技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325035)

丙型肝炎是一種主要經(jīng)血液傳播的疾病，丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)慢性感染可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥性壞死和纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝細(xì)胞癌(hepatic celluler cancar，HCC)。因此，肝炎病毒的早期檢測(cè)對(duì)治療和防御疾病的惡化至關(guān)重要。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)HCV的檢測(cè)技術(shù)越來(lái)越先進(jìn)，如PCR技術(shù)和基因芯片的應(yīng)用等。HCV－RNA核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(nucleic－acid amplification technology，NAT)可精確地檢測(cè)血清中HCV的載量，是預(yù)測(cè)和觀察抗病毒效果的重要指標(biāo)。但HCV RNA在達(dá)到峰值或重新出現(xiàn)前數(shù)天或數(shù)周內(nèi)偶爾也可能檢測(cè)不到[1]。此外，其它很多因素也影響患者的HCV檢出率。目前，美國(guó)已采用了RIBA 3.0試劑檢測(cè)技術(shù)來(lái)檢測(cè)HCV，但是抗－HCV檢測(cè)方法陽(yáng)性率低。另外，由于“窗口期”的存在，仍有一定的漏檢率[2]。

對(duì)于抗－HCV的檢測(cè)，核心蛋白(core，C)和外膜蛋白(envelope，E)被認(rèn)為能有效提高抗－HCV的靈敏度，但其對(duì)抗體的檢出率依賴(lài)于抗原的獲得方法，可能與抗原的構(gòu)象表位有關(guān)[3－4]。而開(kāi)發(fā)HCV抗體蛋白芯片檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)成為科研人員關(guān)注的熱點(diǎn)。在HCV檢測(cè)中，加強(qiáng)和擴(kuò)大對(duì)HCV不同編碼區(qū)的抗體檢測(cè)，是近年來(lái)該領(lǐng)域研究的一個(gè)新熱點(diǎn)，它直接關(guān)系到檢測(cè)技術(shù)的準(zhǔn)確率和應(yīng)用率。

桿狀病毒表面展示(baculovirus surface display)系統(tǒng)是在對(duì)病毒基因組結(jié)構(gòu)和功能深刻認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。通過(guò)在病毒衣殼蛋白插入外源肽、與衣殼蛋白融合表達(dá)或與特異性的錨定部位結(jié)合，桿狀病毒表面展示系統(tǒng)可以在被感染細(xì)胞或病毒粒子的表面大量展示目的多肽或蛋白[5－6]，而且還能對(duì)外源蛋白進(jìn)行糖基化加工和折疊等翻譯后修飾，尤其適合于展示需要特異的翻譯后加工才能有效折疊和具有生物活性的細(xì)胞表面蛋白和分泌蛋白[5，7]。目前研究及應(yīng)用最為廣泛的桿狀病毒表面展示系統(tǒng)是苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(Autographa canifornica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)表面展示系統(tǒng)[6，8]，效率最高的展示措施是將外源肽或蛋白與膜融合蛋白GP64融合形成融合蛋白。外源蛋白插入N端信號(hào)肽后與GP64融合，加工后信號(hào)肽被切除，形成的N端融合蛋白可以穩(wěn)定地表達(dá)在病毒粒子的表面[9]。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)桿狀病毒表面展示系統(tǒng)的特點(diǎn)，我們將HCV的C、E1和E2抗原兩兩融合或三者融合構(gòu)建成重組桿狀病毒并將這些蛋白表達(dá)在病毒粒子的表面;將重組桿狀病毒粒子經(jīng)過(guò)濃縮純化后對(duì)HCV的樣品進(jìn)行檢測(cè)。

材料和方法

1 細(xì)胞系和病毒

實(shí)驗(yàn)所使用的昆蟲(chóng)細(xì)胞系為Sf9。Sf9來(lái)源于Spodoptera frugiperda(草地夜蛾)卵巢細(xì)胞，由中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，武漢)。Sf9傳代培養(yǎng)采用25 cm2的培養(yǎng)瓶以單層細(xì)胞的形式多次傳代，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的Grace培養(yǎng)基(Gibco－BRL)，培養(yǎng)溫度為27℃。

2 主要試劑和儀器

限制性核酸內(nèi)切酶、核酸分子量marker、T4 DNA連接酶及其配套緩沖溶液均購(gòu)自TaKaRa。PCR產(chǎn)物回收試劑盒和質(zhì)粒純化試劑盒購(gòu)自V－Gene。HCV C抗體、Cy3標(biāo)記的羊抗小鼠IgG、堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG和小鼠抗人IgG購(gòu)自深圳晶美生物公司;NBT和BCIP溶液購(gòu)自碧云天生物公司。HCV抗體ELISA試劑盒購(gòu)自上?？迫A公司。分析緩沖液、增強(qiáng)液等購(gòu)自廣州達(dá)瑞公司，時(shí)間分辨熒光免疫分析儀購(gòu)自PE。

3 主要方法

3.1 重組病毒的構(gòu)建及其制備 我們首先將經(jīng)PCR獲得的HCV C、E和CE基因分別插入pSKF64載體的Sal I和Pst I及Pst I和Xba lI位點(diǎn)(C基因上游引物5'－GGG CTG CAG GAG CAC TGC AAC GCG CAA －3'，下游引物 5'－GGG AAG CTT TTA ATA TTG TCT ATT ACG GTT TCT AA－3';E基因上游引物5'－GGG AGA TCT TAC CAA GTG CGC AAT TCC－3'，下游引物 5'－ GGG GAA TTC GCC GCT ACC CGA GCC CGC CTC CGC TTG GGA TAT－3';CE基因上游引物5'－GGG ACT AGT ATG AGC ACG AAT CCT AAA CCT －3'，下游引物5'－GGG CTG CAG CGC CTC CGC TTG GGA TAT－3')，這些質(zhì)粒分別被命名為pSKF－C/E/CE。在此基礎(chǔ)上將Flag、信號(hào)肽及HCV C、E和CE基因通過(guò)Sal I和Pst I及Pst I和Xba lI位點(diǎn)一起克隆到pFastbacDual－GFP載體的相同位點(diǎn)，分別命名為 pFBDeGFP－Flag－HCV C－GP64、pFBDeGFP－Flag－HCV E－GP64和pFBDeGFP－Flag－CE－GP64。然后通過(guò)Bac－to－Bac系統(tǒng)將pFBDeGFP－Flag－HCV C－GP64、pFBDeGFP－Flag－HCV E－GP64和pFBDeGFP－Flag－CEGP64質(zhì)粒轉(zhuǎn)座到Ac－bacmid中，經(jīng)PCR鑒定正確后分別命名為Ac－Flag－HCV C－GP64、Ac－Flag－HCV E－GP64和Ac－Flag－CE－GP64。在35 mm的培養(yǎng)皿中接種1×106的Sf9細(xì)胞，27℃培養(yǎng)過(guò)夜;棄去上層培養(yǎng)基，加入1 mL不含血清的培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，再加入1 mL不含血清的培養(yǎng)基于27℃培養(yǎng)0.5 h以上;在細(xì)胞室中將1～2 μg重組bacmid DNA與10 μL cellfectin分別用無(wú)血清Grace稀釋至50 μL，5 min后將DNA加入稀釋后的cellfectin中，每隔5 min輕輕混勻1次，45 min后在聚丙烯管中輕輕加入900 μL不含血清的Grace培養(yǎng)基，混勻。棄去35 mm培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，加入含有轉(zhuǎn)染混合物的Grace培養(yǎng)基，28℃溫箱培養(yǎng);6 h后用含10%血清的Grace培養(yǎng)替換原有的培養(yǎng)基;3 d后若觀察到GFP表達(dá)說(shuō)明重組病毒包裝成功，收集細(xì)胞上清(重組病毒)保存或進(jìn)行再次感染進(jìn)行功能分析。

3.2 Western blotting 收集病毒感染72 h的Sf9細(xì)胞總蛋白，用SDS－PAGE上樣緩沖液裂解。煮沸10 min后進(jìn)行SDS－PAGE(7.5%)，用半干法將膠上蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。封閉液(含5%脫脂奶粉的TBS)封閉1 h后，以溶解一定濃度Ⅰ抗的封閉液4℃過(guò)夜。經(jīng)TBST洗脫后，以溶解一定堿性磷酸酶標(biāo)記的Ⅱ抗封閉液孵育1 h，經(jīng)TBST洗脫后，BCIP/NBT顯色檢測(cè)。

3.3 免疫熒光染色 在22 mm×22 mm的1.5號(hào)玻璃蓋玻片上培養(yǎng)細(xì)胞，用含2%多聚甲醛的 PBS(pH 7.4)溶液在20℃固定細(xì)胞15 min。用 PBS(pH 7.4)洗 3次，每次 10 min;用含0.2%Triton X－100和1%正常山羊血清(normal goat serum，NGS)的PBS溶液在冰上，透化5 min;用PBS加1%NGS洗3次，每次10 min;在蓋玻片上加30 μL稀釋的抗體，并將蓋玻片倒置在玻璃載玻片上，然后將載玻片放到濕盒里以室溫孵育1 h;用PBS加1%NGS洗3次，每次10 min;在濕盒里與稀釋為4 mg/L的Ⅱ抗，室溫孵育1 h;用PBS洗4次，每次10 min;將蓋玻片封在載玻片上。用激光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)行觀察。

3.4 重組出芽病毒(budded virus，BV)的純化 重組病毒的BV來(lái)源于經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增后的培養(yǎng)基上清。病毒的擴(kuò)增如下，在75 cm2培養(yǎng)瓶中按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=0.1加入桿狀病毒的BV，25℃溫箱培養(yǎng)，當(dāng)BV的產(chǎn)量達(dá)到最高峰時(shí)收集含有BV的培養(yǎng)液。含有病毒的培養(yǎng)液收集后，于1000×g離心10 min，收集上清。收集的上清于4℃、50000×g離心1 h，棄上清，沉淀溶解在PBS溶液中。然后將其加在經(jīng)梯度混合儀制成的25%～56%的蔗糖梯度上，于4℃、100000×g離心2 h;在45%蔗糖濃度的部位有白色帶出現(xiàn)，即重組病毒BV。收集病毒帶，轉(zhuǎn)移至1個(gè)新的離心管中，用PBS稀釋10倍。稀釋后的病毒液在4℃、50000×g離心1 h，棄上清，沉淀溶解在PBS溶液中，病毒粒子經(jīng)負(fù)染后，用透射電子顯微鏡(H－7000FA)鑒定純度。

3.5 免疫膠體金標(biāo)記 將鎳網(wǎng)在純化好的BV樣品液中懸滴反應(yīng)5 min;在濾紙上晾干4℃過(guò)夜;再用含5%牛血清白蛋白(bovine serium albumin，BSA)的PBS(pH 7.2)懸滴反應(yīng)30 min;取出鎳網(wǎng)用0.1%BSA的 TBS(pH 7.4)稀釋抗體(1∶500)作用1 h;然后用 0.1%BSA 的 TBS(pH 7.4)洗滌 3次(每次5 min);再用0.1%BSA的TBS(Tris－HCl緩沖鹽溶液，pH 8.2)稀釋膠體金(1∶25)作用 1 h 后用 0.1%BSA 的TBS洗滌3次(每次5 min);最后用2%磷鎢酸(phosphotungstic acid，PTA)染色3 min，進(jìn)行電鏡觀察。

3.6 間接時(shí)間分辨熒光免疫分析法(time－resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)檢測(cè)臨床樣本HCV IgG (1)固相包被板的制備:分別將HCV C、E、CE的重組桿狀病毒上清用包被液(50 mmol/L，pH 9.6 的碳酸鹽緩沖液)稀釋為1 mg/L，100 μL每孔加入96孔板中，于4℃過(guò)夜。棄去包被液，加入封閉液(去金屬離子的 20 g/L BSA)，150 μL/well，于 37 ℃ 3 h棄去封閉液真空抽干，－20℃保存。(2)Eu3+標(biāo)記鼠抗人IgG的制備與純化:將0.5 mg鼠抗人IgG加入到帶有濾膜的離心管中，以8000 r/min離心3 min。用標(biāo)記緩沖液 (50 mmol/L Na2CO3，pH 9.5)重復(fù)洗滌6 次后，將250 μL 標(biāo)記抗體和0.5 mg Eu3+標(biāo)記試劑混勻后于4℃過(guò)夜。將標(biāo)記抗體加入到Sephadex G－50層析柱(1×30 cm)中，用洗脫液洗脫。收集流出液(1 mL/tube)，測(cè)定蛋白含量，合并洗脫峰的各管。(3)間接TRFIA檢測(cè)人HCV IgG程序:向包被板中加90 μL樣品稀釋液，10 μL質(zhì)控血清或臨床病人血清，室溫孵育1 h。用洗滌液洗板4次，拍干。再加入1∶200稀釋的Eu3+標(biāo)記鼠抗人IgG 100 μL，于室溫孵育40 min。用洗滌液洗板6次，拍干。最后加入200 μL增強(qiáng)液振搖5 min后由時(shí)間分辨熒光免疫分析儀檢測(cè)熒光值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，配對(duì)數(shù)據(jù)用McNemer檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 重組Bacmid的構(gòu)建

利用AcMNPV Bac－to－Bac系統(tǒng)，分別以pFBDeGFPFlag－HCV C－GP64、pFBDeGFP－Flag－HCV E－GP64和pFBDeGFP－Flag－CE－GP64質(zhì)粒轉(zhuǎn)座含有輔助質(zhì)粒(helper plasmid)與Ac－bacmid(AcMNPV的Bac to Bac系統(tǒng))的大腸桿菌DH10B，得到重組AcMNPV bacmid:Ac－Flag－HCV C－GP64、Ac－Flag－HCV E－GP64和Ac－Flag－CE－GP64，見(jiàn)圖1A。利用M13F(M13上游引物)和目的基因下游引物(HCV C下游引物5'－GGG GGA TCC TGT CGT GGC GAT TGT AGC ACG AAT CCT AAA C－3';HCV E下游引物:5’－GGG CTG CAG CGC CTC TTG GGA TAT－3’)進(jìn)行 PCR 鑒定:分別產(chǎn)生了3.3 kb、4.4 kb 和 5.0 kb 左右的帶，見(jiàn)圖 1B，表明目的片段插入的位置正確。將重組bacmid DNA分別轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞得到重組病毒vAc－Flag－HCV C－GP64、vAc－Flag－HCV E－GP64和 vAc－Flag－CE－GP64。同時(shí)構(gòu)建vAc－bacmid－GFP作為對(duì)照病毒。

2 Western blotting檢測(cè)

分別收集重組病毒感染后的細(xì)胞，檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。免疫印跡顯示當(dāng)用HCV C抗體檢測(cè)時(shí)，重組病毒vAc－Flag－HCV C－GP64的樣品有21 kD的特征帶，見(jiàn)圖2A，重組病毒vAc－Flag－CE－GP64的樣品有84 kD的特征帶出現(xiàn)，見(jiàn)圖2C。當(dāng)用HCV E抗體檢測(cè)重組病毒vAc－Flag－CE－GP64的樣品時(shí)，出現(xiàn)63 kD的特征帶，見(jiàn)圖2B。在這些檢測(cè)過(guò)程中，對(duì)照病毒vAc－bacmid－GFP感染的樣品中無(wú)這些特征帶出現(xiàn)。Western blotting結(jié)果證明能夠在vAc－Flag－HCV C－GP64、vAc－Flag－HCV E－GP64和vAc－Flag－CE－GP64感染的細(xì)胞中檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)，說(shuō)明HCV C、E和CE能夠成功展示在重組病毒粒子的表面。

3 HCV C、E和CE融合蛋白在被感染sf9細(xì)胞上的定位

重組病毒 vAc－Flag－HCV C－GP64、vAc－Flag－HCV E－GP64和vAc－Flag－CE－GP64和野生型病毒AcMNPV以10 MOI感染接種于蓋玻片上的sf9細(xì)胞，在感染后72 h觀察細(xì)胞內(nèi)紅色熒光的分布情況。在對(duì)照病毒vAc－bacmid－GFP感染后的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜上均未觀察到紅色特異性熒光;而在重組病毒感染后的細(xì)胞膜上看到一圈強(qiáng)烈的紅色特異性熒光(代表HCV C、E和CE融合蛋白)，細(xì)胞內(nèi)則未出現(xiàn)紅色熒光，見(jiàn)圖3。這說(shuō)明HCV C、E和CE融合蛋白最終是定位在被感染Sf9細(xì)胞的膜上，隨后在病毒粒子出芽過(guò)程中整合到病毒粒子上。

4 HCV C、E和CE融合蛋白在BV上的定位

圖4顯示，在重組病毒 vAc－Flag－HCV C－GP64(圖4B)、vAc－Flag－HCV E－GP64(圖4C)和vAc－Flag－CEGP64(圖4D)的BV上看到了大量的黑色金顆粒，對(duì)照病毒vAc－bacmid－GFP的BV上沒(méi)有(圖4A)。這表明HCV C、E和CE融合蛋白展示在BV囊膜上。

5 間接TRFIA檢測(cè)人HCV IgG

收集溫州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院丙型肝炎患者血清106例，分別以間接ELISA和間接TRFIA檢測(cè)人HCV IgG。TRFIA檢測(cè)時(shí)，分組如下:TRFIA(C):包被HCV C重組桿狀病毒;TRFIA(E):包被HCV E重組桿狀病毒;TRFIA(C+E):包被HCV C重組桿狀病毒和HCV E重組桿狀病毒;TRFIA(CE):包被HCV CE重組桿狀病毒。

Figure1.Construction of the recombinant bacmids.A:the strategy for insertion of the gene cassettes into the polyhedrin locus of the Ac-MNPV bacmid.FLAG－HCV C，E or CE was fused with AcMNPV GP64 protein after the signal peptide(SP).The cassettes depicted were inserted into the attB site(indicated by right and left insertion sites，Tn7R and Tn7L)in the polyhedrin locus by Tn－based transposition and generated the recombinant bacmids，Ac－Flag－C－GP64，Ac－Flag－E－GP64 and Ac－Flag－CE－GP64.B:identification of recombinant bacmids by PCR.a:Ac－Flag－C－GP64(using M13 forward primer and HCV C reverse primer).1:negative control;2，3:Ac－Flag－C－GP64.b:Ac－Flag－E－GP64(using M13 forward primer and HCV E reverse primer).1:negative control;2，3:Ac－Flag－E－GP64.c:Ac－Flag－CE－GP64(using M13 forward primer and HCV E reverse primer).1:negative control;2，3:Ac－Flag－CE－GP64.圖1 重組病毒的構(gòu)建

Figure2.Expression of fusion proteins in Sf9 cells infected with recombinant viruses was detected by Western blotting.M:protein marker;1:negative control(vAc－bacmid－GFP);2:vAc－Flag－C－GP64(A)，vAc－Flag－E－GP64(B)or vAc－Flag－CE－GP64(C).圖2 重組病毒蛋白在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)

Figure3.Immunofluorescence analysis of HCV C，E and CE expression in infected Sf9 cells using an anti－HCV core monoclonal antibody.Sf9 cells were infected with vAc－bacmid－GFP(A)，vAc－Flag－C－GP64(B)，vAc－Flag－E－GP64(C)and vAc－Flag－CE－GP64(D)at multiplicity of infection(MOI)of 10 and were examined under confocal microscope.1:green fluorescent(GFP);2:red fluorescent(Cy3 － labeled HCV C，E or CE);3:merged images.圖3 HCV C，E和CE融合蛋白在感染的Sf9細(xì)胞中的分布

ELISA檢測(cè)丙型肝炎患者HCV抗體的陽(yáng)性率為84.0%(89/106);TRFIA(C)和TRFIA(E)檢測(cè)陽(yáng)性率分別為58.5%(62/106)、53.8%(57/106)，與 ELISA 檢測(cè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。TRFIA(C+E)和TRFIA(CE)檢測(cè)陽(yáng)性率分別為78.3%(83/106)和80.2%(85/106)，與ELISA檢測(cè)結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表1。

TRFIA和ELISA檢測(cè)HCV抗體的靈敏度比較:將HCV抗體陽(yáng)性質(zhì)控血清以 PBS 溶液進(jìn)行 1(未稀釋)、2、4、8、16、32、64、128 倍稀釋?zhuān)?ELISA 和 TRFIA(C)、TRFIA(E)、TRFIA(C+E)和TRFIA(CE)進(jìn)行檢測(cè)。TRFIA(C+E)和TRFIA(CE)的檢測(cè)敏感性高于ELISA，TRFIA(C)檢測(cè)敏感性和ELISA基本相同，TRFIA(E)的檢測(cè)敏感性略低于ELISA，見(jiàn)表2。

討 論

丙型肝炎是一種流行較為廣泛的病毒性疾病。據(jù)估計(jì)，全球有1.7億人口，即全世界人口的3%左右感染了HCV(世界衛(wèi)生組織，1999年)。而且，每年有300～400萬(wàn)新發(fā)病例。在HCV感染者中，實(shí)際上僅有20%的患者被診斷出丙型肝炎。HCV慢性感染可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至 HCC[10]。因此加強(qiáng)對(duì)HCV的檢測(cè)具有十分重要的意義。但是由于感染HCV后血中抗體(抗－HCV)出現(xiàn)時(shí)間晚，從HCV感染后到抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)的時(shí)間平均為50～70 d，有的患者可延長(zhǎng)至6～9個(gè)月，檢測(cè)的“窗口期”較長(zhǎng)。對(duì)于抗－HCV的檢測(cè)，C和E蛋白被認(rèn)為能有效提高抗－HCV的靈敏度[11－12]。因此在HCV檢測(cè)中，加強(qiáng)和擴(kuò)大對(duì)HCV不同編碼區(qū)的抗體檢測(cè)，它直接關(guān)系到檢測(cè)技術(shù)的準(zhǔn)確率和應(yīng)用率。

Figure4.Electron micrograph of immunogold－labeled purified vAc－bacmid－GFP(A)，vAc－Flag－C－GP64(B)，vAc－Flag－E－GP64(C)and vAc－Flag－CE－GP64(D)BVs.BVs were probed using anti－HCV core antibody counterstained with gold spheres coupled to anti－mouse IgG.圖4 免疫膠體金檢測(cè)HCV C，E和CE在BV上的定位

表1 丙型肝炎患者血清的TRFIA和ELISA檢測(cè)結(jié)果Table1.Results of serum of patients with HCV detected by TRFIA and ELISA(n=106)

表2 TRFIA和ELISA檢測(cè)的靈敏度比較Table2.Comparison of the sensitivity between TRFIA and ELISA

桿狀病毒展示系統(tǒng)具有許多優(yōu)點(diǎn)，能夠通過(guò)在病毒基因組上直接克隆展示片段或在感染昆蟲(chóng)細(xì)胞表面表達(dá)以及在病毒顆粒表面表達(dá)來(lái)展示抗原產(chǎn)生抗體及進(jìn)行疫苗相關(guān)研究展示復(fù)雜有活性的蛋白[13－14]。由于桿狀病毒展示表面展示系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，使其在高親和力抗體及多肽藥物的篩選、蛋白質(zhì)抗原表位分析、新受體及天然配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的識(shí)別和鑒定、藥物(激動(dòng)劑和多肽藥物)篩選、設(shè)計(jì)和制備、重組疫苗的建立、酶的固定化和再生等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[11－12，15]。

為了提高HCV的檢測(cè)率，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)桿狀病毒表面展示系統(tǒng)構(gòu)建了HCV C、E和CE融合蛋白的重組病毒。通過(guò)Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在重組病毒感染的細(xì)胞中有HCV C、E和CE蛋白的存在(圖2);同時(shí)免疫熒光染色結(jié)果表明HCV C、E和CE融合蛋白定位在被感染Sf9細(xì)胞的膜上(圖3)。進(jìn)一步，免疫膠體金技術(shù)將HCV C、E和CE融合蛋白定位于BV的囊膜上(圖4)，表明成功地將HCV C、E和CE融合蛋白展示在病毒的表面。對(duì)重組病毒濃縮后，建立時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)檢測(cè)HCV抗體的方法，與ELISA進(jìn)行比較，包被有2種蛋白的TRFIA(C+E)和TRFIA(CE)的檢測(cè)敏感性高于ELISA，而只包被一種蛋白的TRFIA(C)或TRFIA(E)檢測(cè)敏感性和ELISA基本相同。用HCV臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示單獨(dú)包被HCV C重組病毒或HCV E重組病毒的TRFIA檢測(cè)陽(yáng)性率明顯低于ELISA檢測(cè)，這是由于ELISA試劑盒的微孔板上包被了更多的HCV特異性蛋白，提高了HCV抗體的檢出率;包被HCV CE重組病毒時(shí)TRFIA檢測(cè)陽(yáng)性率為80.2%，明顯高于單獨(dú)包被HCV C和HCV E重組病毒的TRFIA檢測(cè)，接近目前使用的ELISA檢測(cè)試劑盒。我們擬通過(guò)改進(jìn)濃縮純化的方法和工藝，進(jìn)一步提高丙型肝炎的診斷敏感性，為HCV抗體檢測(cè)帶來(lái)新的希望。

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