樊 榮， 王文清， 李 榕， 張海鋒

(第四軍醫(yī)大學 1基礎醫(yī)學部生理學教研室，2唐都醫(yī)院血液科，陜西 西安 710032)

1000-4718(2012)10-1761-05

2012-04-20

2012-09-05

國家自然科學基金資助項目(No.81270401)

△通訊作者 Tel:029-84717724; E-mail:wangdacong@yahoo.com.cn

NO在脂聯(lián)素抑制高脂血癥大鼠血小板聚集中的作用*

樊 榮1， 王文清2△， 李 榕1， 張海鋒1

(第四軍醫(yī)大學1基礎醫(yī)學部生理學教研室，2唐都醫(yī)院血液科，陜西 西安 710032)

目的探討一氧化氮(NO)信號轉(zhuǎn)導通路在脂聯(lián)素抑制高脂血癥血小板聚集機制中的作用。方法采用成年大鼠飼以高脂飼料14周，分離其血小板并以重組脂聯(lián)素(rAPN)孵育。采用免疫熒光、Western blotting等方法觀察檢測血小板聚集、NO含量、超氧化物含量、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)/誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達和抗氧化物活性。結(jié)果采用rAPN處理能抑制高脂血癥誘導的血小板聚集(P<0.05)，并導致血小板NO的生成顯著減少。同時，在高脂血癥血小板中，采用rAPN處理還能顯著減少超氧化物的生成(降低62%,P<0.05) 并增強其抗氧化能力(增加38%,P<0.05)。此外，高脂血癥誘導的eNOS磷酸化的降低和iNOS表達的增加在rAPN處理后被顯著逆轉(zhuǎn)(P<0.05,P<0.01)。結(jié)論脂聯(lián)素是一種抑制高脂血癥血小板聚集的脂肪細胞因子，其機制與減少超氧化物水平、增加抗氧化物活性和阻斷iNOS的表達有關(guān)。

脂聯(lián)素； 血小板； 高脂血癥

代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)已成為20世紀以來嚴重危害人類健康的一大殺手。它可通過一系列代謝及血液動力學改變，包括內(nèi)皮細胞損害及動脈粥樣硬化，導致心血管疾病發(fā)生率顯著增加。高脂血癥，作為代謝綜合征的一種主要臨床征狀，與動脈粥樣硬化及血栓形成密切相關(guān)。 脂聯(lián)素是一種主要由脂肪組織分泌的細胞因子，在血漿中含量豐富。大量研究表明脂聯(lián)素是一種內(nèi)源性的抗血小板聚集因子，其血漿水平的降低與血栓形成及心血管事件的高風險有關(guān)[1]。 目前脂聯(lián)素抑制血小板聚集的機制仍很不清楚。血小板通過刺激眾多信號轉(zhuǎn)導途徑而保證其在血管損傷部位的快速活化。同時，血小板可以產(chǎn)生一氧化氮(nitric oxide, NO)。大量研究表明，NO可通過刺激可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(soluble guanylyl cyclase，sGC)以及下游的蛋白激酶G(protein kinase G,PKG)抑制血小板活化。然而，脂聯(lián)素是否可通過調(diào)節(jié)NO的生成對血小板的活化聚集產(chǎn)生影響，從而抑制血栓形成及心血管事件的發(fā)生，至今尚無定論。 本研究旨在觀察脂聯(lián)素對高脂血癥誘導的血小板聚集的影響，并進一步探討了其作用機制是否與內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)/NO信號通路有關(guān)。

材 料 和 方 法

1動物與材料

20只雄性4周齡SD大鼠及高膽固醇飼料[配方：78.8%基礎飼料、10%豬油，10%蛋黃粉、1%膽固醇及0.2%豬膽鹽(參見中華人民共和國衛(wèi)生部2003年頒布的保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范)]，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。重組脂聯(lián)素(recombinant full-length adiponectin, rAPN)購自BioVendor生物制品公司(Czech Republic)?？寡趸钚詸z測試劑盒購自南京建成生物工程研究所?？筽-eNOS、抗eNOS、抗誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)及抗β-actin抗體均購自Cell Signal。14周正?；蚋咧桂B(yǎng)后，動物以20%烏拉坦麻醉，采集腹腔靜脈血，立即分離血小板。實驗按以下方法進行。

2方法

2.1實驗分組 實驗分組為：正常對照大鼠血小板組，高脂血癥血小板組，高脂血癥血小板+rAPN組，高脂血癥血小板+rAPN+ L-單甲基精氨酸(NG-monomethyl-L-arginine, L-NMMA)組等。

2.2血脂水平的測定 血漿膽固醇以及甘油三酯水平由生化檢測儀(Cobas Integra 400 Plus, Roche)按相關(guān)操作規(guī)范進行。

2.3血小板分離 大鼠血小板的分離按以下方法進行[2]。腹腔靜脈血使用檸檬酸(29.9 mmol/L 檸檬酸鈉, 113.8 mmol/L 葡萄糖, 72.6 mmol/L 氯化鈉，2.9 mmol/L 檸檬酸, pH 6.4)作為抗凝劑，富含血小板的血漿(platelet-rich plasma，PRP)以全血在200×g離心20 min獲得，洗滌的血小板(washed platelets，WP)從PRP(含前列腺素E1， 50 μg/L)中800×g離心12 min獲得。血小板調(diào)整密度為2×1011/L，在臺氏液 (150 mmol/L NaCl, 5 mmol/L HEPES, 0.55 mmol/L NaH2PO4, 7 mmol/L NaHCO3, 2.7 mmol/L KCl, 0.5 mmol/L MgCl2， 5.6 mmol/L 葡萄糖, pH 7.4) 中備用。

2.4血小板聚集實驗 血小板聚集實驗采用改良的血小板比濁法進行[3]，使用臺氏液調(diào)整最小吸光度的基線。血小板聚集采用血小板聚集檢測系統(tǒng)(PACKS-4型四通道血小板聚集儀，Helena)在持續(xù)恒定的攪拌狀況下(900 r/min×6 min)以吸光度(A)評估的形式進行。大鼠 WP置于20孔培養(yǎng)板，在37 ℃下使用PBS或者10 mg/L rAPN，孵育1 h，加入凝血酶(1×103U/L) 1～5 min后血小板聚集時開始測定WP吸光值。一部分rAPN處理的血小板之前采用NOS抑制劑——L-NMMA(1 mmol/L)提前孵育10 min。每個處理組含有5孔血小板。聚集的百分率通過公式計算，以吸光度值衡量：聚集率(%)=(加凝血酶之前的A值-加凝血酶之后的A值)/( 加凝血酶之前的A值-臺氏液的A值)×100%。

血小板聚集同時還用熒光顯微鏡以及免疫熒光檢測，方法同前。血小板在25 ℃采用1%多聚甲醛固定30 min，涂片至載玻片上，包被的玻璃板使用PBS洗滌3次，異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)結(jié)合的兔抗鼠CD9單抗加入，37 ℃孵育 1 h，PBS洗滌4次。隨后免疫熒光檢測。對每個玻片隨機選取10個視野，總計數(shù)100個血小板來確定聚集指數(shù)，采用盲法分析。

2.5總NO測定 血小板總NO的含量通過測定亞硝酸鹽含量進行。血小板勻漿取上清液，按試劑盒要求，采用Griess呈色反應及比色方法測定NO含量[4]，以NaNO2為標準品作標準曲線，用分光光度計測定吸光度(540 nm)并進行計算。正常及高脂血癥大鼠的血小板采用rAPN (10 mg/L)或rAPN加L-NMMA進行。

2.6免疫印跡法檢測eNOS 及iNOS的表達 血小板勻漿后，經(jīng)Bradford法蛋白定量，取相同數(shù)量(50 μg)的蛋白樣品進行SDS-PAGE，并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。滴加50 g/L脫脂奶粉封閉膜30 min，分別滴加1∶1 000工作濃度的抗p-eNOS、抗eNOS、抗iNOS或抗β-actin抗體孵育膜過夜。以工作濃度為1∶500的抗鼠或抗兔源性的IgG抗體于37 ℃孵育1 h，洗膜后用凝膠成像系統(tǒng)進行化學發(fā)光，采用LabImage軟件分析數(shù)據(jù)。

2.7血小板抗氧化活性分析 血小板以0.9%氯化鈉溶液超聲溶解，3 000×g離心5 min，去除微粒，總抗氧化活性檢測參照試劑盒說明書進行。30 μL的上清液加入含有黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶和羥胺的反應緩沖液中，37 ℃孵育40 min，亞硝酸鹽的含量采用Griess反應測定。血小板抗氧化活性與亞硝酸鹽含量呈負相關(guān)。

2.8血小板超氧化物含量的測定 血小板超氧化物的測定采用流式注射化學發(fā)光法進行[5]。超氧化物含量以每微克蛋白的化學發(fā)光強度 [CI/(μg protein)]進行定量。

3統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1血脂水平

血漿總膽固醇和甘油三酯水平在高脂喂養(yǎng)大鼠中明顯高于正常對照飲食組[總膽固醇：(2.0±0.1) mmol/Lvs(1.6±0.1) mmol/L,P<0.01；甘油三酯：(1.5±0.3) mmol/Lvs(1.1±0.3) mmol/L,P<0.05]。

2rAPN處理能抑制高脂血癥誘導的血小板聚集

如圖1所示，使用凝血酶處理5 min，與正常血小板相比，高脂血癥能明顯增加血小板聚集(P<0.01)。而提前使用rAPN預處理1 h則能明顯減少高脂血癥血小板的聚集(P<0.05)。在之前添加1 mmol/L L-NMMA能顯著減弱rAPN對血小板聚集的抑制作用(P<0.01)。與正常血小板相比，高脂血小板表現(xiàn)出明顯的聚集效應，rAPN處理后其聚集效應有所減低。加L-NMMA后，高脂血癥血小板聚集又出現(xiàn)增強現(xiàn)象，見圖2。另外，高脂血小板與對照組相比，表現(xiàn)出明顯的聚集效應[(31±5)%vs(20±3)%，P<0.05]，加rAPN后高脂血癥血小板的聚集出現(xiàn)中等程度的減低[(31±5)%vs(25±3)%,P<0.05]。加L-NMMA后，血小板聚集又出現(xiàn)明顯的促進效應[(25±3)%vs(56±7)%,P<0.01]。

3rAPN處理能降低高脂血癥誘導的NO生成

盡管采用rAPN處理的血小板能明顯降低高脂血癥介導的血小板聚集，但此種處理減少而不是增加了總NO的生成(P<0.05), 見圖3。結(jié)果表明還可能有更復雜的信號機制參與了rAPN對抗高脂血癥誘導的血小板聚集。

4rAPN處理促進高脂血癥血小板eNOS激活并降低iNOS的表達

在高脂血癥血小板中，eNOS磷酸化水平與正常血小板相比顯著降低(P<0.05)，iNOS的表達則是顯著增多(P<0.01)。高脂血癥血小板rAPN預處理可使eNOS磷酸化水平顯著升高(P<0.05)， iNOS表達顯著降低，即rAPN對p-eNOS和iNOS的表達具有反向調(diào)節(jié)作用，這種作用可能是rAPN明顯抑制血小板聚集卻減少總NO產(chǎn)生的重要原因，見圖4。

圖1比濁法檢測rAPN對正常及高脂血小板的聚集效應

Figure 2. Effect of rAPN on hyperlipidemia-induced platelet aggregation detected by immunofluorescence method.A:control;B:HL;C:HL+rAPN;D:HL+rAPN+L-NMMA.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsHL;△△P<0.01vsHL+rAPN.

圖2免疫熒光法檢測rAPN對高脂血癥誘導的血小板的聚集效應

圖3正常血小板與使用PBS、rAPN或rAPN+L-NMMA處理的高脂血小板總NO的生成

5rAPN處理能明顯減少高脂血癥血小板超氧化物的生成并提高抗氧化能力

高脂血癥血小板超氧化物合成較正常血小板高出2.5倍，使用rAPN處理可明顯減少高脂血癥血小板超氧化物的水平(與PBS處理的高脂血癥血小板相比，減少62%,P<0.05)。另外，rAPN處理后，可顯著增加高脂血癥血小板的抗氧化能力(與PBS處理的高脂血癥血小板相比，增加38%,P<0.05),見圖5。

討 論

本研究中，我們觀察到rAPN的急性處理能明顯降低高脂血癥誘導的血小板聚集。其次，我們提供了直接的證據(jù)表明抑制過氧化物的產(chǎn)生，抑制iNOS介導的NO的生成是脂聯(lián)素發(fā)揮其抗血栓形成效應的主要機制。這些結(jié)果表明在代謝性疾病中，脂聯(lián)素水平的減低有助于血栓的形成，并提供了rAPN臨床應用的可能性，其可能是一種應用于動脈粥樣硬化代謝性疾病的有效治療因子。

圖4rAPN對正常及高脂血小板eNOS磷酸化以及iNOS表達的效應

圖5rAPN抑制高脂血癥誘導的血小板超氧化物的過表達和抗氧化能力的降低

肥胖，代謝綜合征以及動脈粥樣硬化的緊密聯(lián)系已經(jīng)得到證實[6]。然而，肥胖促進血栓形成的機制仍不十分清楚。目前越來越多的注意力集中到來源于脂肪組織的血漿蛋白的直接抗血栓效應，特別是脂聯(lián)素[7]。在糖尿病、代謝綜合征以及冠狀動脈疾病患者體內(nèi)，觀察到血漿脂聯(lián)素的水平是降低的[8]。許多動物模型以及人體研究表明脂聯(lián)素是一種重要的抗動脈粥樣硬化分子，其減少可以導致血小板聚集及血栓形成[1,9]。本研究采取了不同的途徑證實短時間的rAPN處理能顯著減低高脂血癥相關(guān)的血小板聚集。與我們的結(jié)果相比較，Riba等[2]認為重組的脂聯(lián)素球形片段(gAd)而不是rAPN，可以通過酪氨酸激酶依賴的信號通路，刺激血小板聚集。造成這兩個實驗結(jié)果的差異可能是不同脂聯(lián)素亞型通過不同的受體和/或各自獨特的活化通路而對血小板的聚集產(chǎn)生了不同的效應。

研究表明rAPN通過其抗氧化特性抑制血小板聚集。首先，脂聯(lián)素可以明顯逆轉(zhuǎn)高脂血癥誘導的抗氧化活性的降低。由于抗氧化分子的增加或者氧化分子產(chǎn)生的減少能增強抗氧化活性，我們隨后檢測了脂聯(lián)素對于超氧化物生成的效應，與Sanguigni等[10]的研究一致，我們發(fā)現(xiàn)高脂血癥血小板超氧化物的生成增加, 而脂聯(lián)素則可以顯著抑制其產(chǎn)生。文獻報道超氧化物和NO反應的速度比超氧化物和超氧化物歧化酶的反應速度快3倍[11]。前者的反應不僅能導致NO快速失活，促進白細胞及血小板聚集，也能產(chǎn)生過氧亞硝酸鹽陰離子(ONOO-)，一種高反應性和細胞毒性的分子[12]。因此這種過氧化物/NO反應是一種“毒性開關(guān)”，是血栓形成過程中的一個重要發(fā)病機制。

血小板中存在L-精氨酸-NOS-NO信號通路[13]，越來越多的證據(jù)表明NO能抑制血小板聚集及活化[14]。既往在血小板內(nèi)已表明血小板能夠活化eNOS并增加NO合成[15-16]。有趣的是我們的結(jié)果表明盡管脂聯(lián)素處理能夠增加eNOS活性卻減少NO合成。進一步研究發(fā)現(xiàn)高脂血癥誘導iNOS的過表達，其可導致NO的過量生成，采用脂聯(lián)素能抑制高脂血小板iNOS表達。同時在高脂血癥時，NO和過量生成的超氧化物快速反應形成過氧化亞硝酸鹽，一種NO的毒性代謝產(chǎn)物，能夠?qū)е卵“骞δ苁д{(diào)[17-18]，以上實驗結(jié)果表明脂聯(lián)素抑制血小板活化可能是通過抑制NO的失活并通過抗氧化特性抑制伴隨的過氧化亞硝酸鹽的形成實現(xiàn)的。

[1] Ekmekci H, Ekmekci OB, Erdine S, et al. Effects of serum homocysteine and adiponectin levels on platelet aggregation in untreated patients with essential hypertension[J]. J Thromb Thrombolysis, 2009，28(4):418-424.

[2] Riba R, Hughes CE, Graham A, et al. Globular adiponectin induces platelet activation through the collagen receptor GPVI-Fc receptor gamma chain complex[J]. J Thromb Haemost，2008，6(6): 1012-1020.

[3] 張 梅, 余清聲. 中華眼鏡蛇毒F組份對血小板活化時蛋白酪氨酸磷酸化的影響[J].中國病理生理雜志,2005,21(2)：293-295.

[4] Cosentino F, Hishikawa K, Katusic ZS, et al. High glucose increases nitric oxide synthase expression and superoxide anion generation in human aortic endothelial cells[J]. Circulation，1997， 96(1): 25-28.

[5] Yao D, Vlessidis AG, Gou Y, et al. Chemiluminescence detection of superoxide anion release and superoxide dismutase activity: modulation effect ofPulsatillachinensis[J]. Anal Bioanal Chem， 2004， 379(1): 171-177.

[6] Cooper-dehoff RM, Pepine CJ. Metabolic syndrome and cardiovascular disease: challenges and opportunities[J]. Clin Cardiol， 2007，30(12): 593-597.

[7] Goldstein BJ, Scalia R. Adiponectin: a novel adipokine linking adipocytes and vascular function [J]. J Clin Endocrinol Metab， 2004，89(6): 2563-2568.

[8] Ouchi N, Shibata R, Walsh K. Cardioprotection by adiponectin[J]. Trends Cardiovasc Med， 2006， 16(5): 141-146.

[9] Kato H, Kashiwagi H, Shiraga M, et al. Adiponectin acts as an endogenous antithrombotic factor[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2006， 26(1): 224-230.

[10]Sanguigni V, Pignatelli P, Caccese D, et al. Increased superoxide anion production by platelets in hypercholesterolemic patients[J]. Thromb Haemost， 2002， 87(5): 796-801.

[11]Huie RE, Padmaja S. The reaction of no with superoxide[J]. Free Radic Res Commun， 1993，18(4): 195-199.

[12]Beckman JS, Koppenol WH. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite: the good, the bad, and ugly[J]. Am J Physiol， 1996， 271(5 Pt 1): C1424-C1437.

[13]Sase K, Michel T. Expression of constitutive endothelial nitric oxide synthase in human blood platelets[J]. Life Sci， 1995， 57(22): 2049-2055.

[14]Gkaliagkousi E, Ritter J, Ferro A, et al. Platelet-derived nitric oxide signaling and regulation[J]. Circ Res， 2007， 101(7): 654-662.

[15]Chen H, Montagnani M, Funahashi T, et al. Adiponectin stimulates production of nitric oxide in vascular endothelial cells[J]. J Biol Chem， 2003， 278(45): 45021-45026.

[16]Li Z, Xi X, Gu M, et al. A stimulatory role for cGMP-dependent protein kinase in platelet activation[J]. Cell， 2003， 112(1): 77-86.

[17]Redondo PC, Jardin I, Hernndez-Cruz JM, et al. Hydrogen peroxide and peroxynitrite enhance Ca2+mobilization and aggregation in platelets from type 2 diabetic patients[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2005， 333(3): 794-802.

[18]Olas B, Wachowicz B. Role of reactive nitrogen species in blood platelet functions[J]. Platelets， 2007， 18(8): 555-565.

Effectofnitricoxideonadiponectin-inducedinhibitionofplateletaggregationinhyperlipidemiarats

FAN Rong1, WANG Wen-qing2, LI Rong1, ZHANG Hai-feng1

(1DepartmentofPhysiology,SchoolofBasicMedicalSciences,2DepartmentofHematology,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China.E-mail:wangdacong@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the mechanism that adiponectin inhibits platelet aggregation via nitric oxide (NO) signaling pathway.METHODSAdult rats were fed with normal or high-fat diet for 14 weeks. Their platelets were immediately isolated and treated with or without recombinant full-length adiponectin (rAPN). The platelet aggregation, NO and superoxide production, endothelial nitric oxide synthase (eNOS)/inducible NOS (iNOS) expression, and antioxidant capacity were determined.RESULTSTreatment with rAPN inhibited platelet aggregation induced by hyperlipidemia (P<0.05). Interestingly, total NO, a crucial molecule depressing platelet aggregate and thrombus formation, was significantly reduced, rather than increased in rAPN-treated platelets. Treatment with rAPN significantly decreased superoxide production by 62% (P<0.05) and increased antioxidant capacity by 38% (P<0.05) in hyperlipidemic platelets. Importantly, hyperlipidemia-induced reduction of eNOS phosphorylation and increase in iNOS expression were markedly reversed by rAPN treatment (P<0.05 andP<0.01, respectively).CONCLUSIONAdiponectin is an adipokine that inhibits platelet aggregation by enhancing eNOS activation and attenuating oxidative/nitrative stress including blockage of iNOS expression and superoxide production.

Adiponectin; Blood platelets; Hyperlipidemia

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.10.006