余國偉， 陳 潔， 陳瑩瑩， 鄭鳴之， 沈岳良△

(浙江大學醫(yī)學院 1附屬第一醫(yī)院心胸外科，2病理與病理生理學系，浙江 杭州 310058；3浙江醫(yī)學高等?？茖W校藥理教研室，浙江 杭州 310053)

1000-4718(2012)10-1773-06

2012-04-28

2012-08-01

國家自然科學基金資助項目(No. 81070201)；浙江省自然科學基金資助項目(No. Y2100092);浙江省教育廳科研項目(No. Y201019167)

△通訊作者 Tel： 0571-88208250; 0571-87692678； E-mail： shenyueliang@zju.edu.cn; zmzjjpdd181@sina.com

HSP90依賴的Akt線粒體轉(zhuǎn)位參與IGF-1對低溫保存心臟的保護作用*

余國偉1， 陳 潔2， 陳瑩瑩2， 鄭鳴之3△， 沈岳良2△

(浙江大學醫(yī)學院1附屬第一醫(yī)院心胸外科，2病理與病理生理學系，浙江 杭州 310058；3浙江醫(yī)學高等?？茖W校藥理教研室，浙江 杭州 310053)

目的觀察胰島素樣生長因子1(IGF-1)是否可對抗低溫保存誘導的心肌損傷，并探討其可能的機制。方法觀察SD大鼠心臟低溫保存9 h后，再灌注期左心室發(fā)展壓(LVDP)和細胞凋亡指數(shù)的變化。Western blotting法檢測蛋白激酶B(Akt)蛋白表達。結(jié)果(1)Celsior保存液中加入10 nmol/L IGF-1可促進低溫保存9 h后心臟收縮功能的恢復、減少心肌細胞凋亡的發(fā)生、抑制線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔開放。(2)IGF-1可上調(diào)心臟Akt蛋白磷酸化水平。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)特異性抑制劑LY294002不僅可降低IGF-1誘導的Akt磷酸化水平，且可逆轉(zhuǎn)IGF-1促進低溫保存心臟心功能的恢復和抗凋亡作用。(3)抑制熱休克蛋白90(HSP90)可降低IGF-1誘導的Akt磷酸化和線粒體轉(zhuǎn)位，阻斷IGF-1的心肌保護作用。結(jié)論IGF-1可明顯減少低溫保存心臟心肌細胞凋亡的發(fā)生，促進再灌注期心功能的恢復，其機制可能與HSP90依賴性Akt的激活和線粒體轉(zhuǎn)位有關。

心臟保存； 胰島素樣生長因子1； Akt； 熱休克蛋白質(zhì)90； 線粒體

心臟移植是一種用于治療嚴重冠心病等終末期心臟病患者的有效外科手段。減輕供心低溫保存過程中的損傷是心臟移植成功的關鍵，改良保存液配方可以相對延長供心的保存時間，既為潛在的免疫配型贏得機會，也能使遠距離獲取供心成為可能[1]。但遺憾的是，目前臨床上心臟的低溫保存時間局限在4～6 h以內(nèi)，這與其它器官如肝、腎、胰的保存時間相比要短得多。因而如何提高供心在長時程低溫保存的有效性，延長供心保存時間，是當前迫切需要解決的問題。胰島素樣生長因子1(insulin like growth factor 1，IGF-1)是一種與胰島素原有高度同源性的多肽，具有促細胞分化、增殖功能和胰島素樣代謝作用。研究表明，IGF-1受體廣泛存在于包括心血管系統(tǒng)在內(nèi)的不同組織中，IGF-1可能通過自分泌和/或旁分泌機制對心臟起生理和病理調(diào)節(jié)作用，如IGF-1參與胚胎和出生早期的心臟發(fā)育，而且在心肌肥厚的形成中起了重要的作用[2]。而最近的研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1還可減輕心肌缺血再灌注損傷[3]；減少心肌組織重構(gòu)，改善心力衰竭[4]；減輕高脂飲食誘導的心肌收縮功能減弱[5]。這些實驗證據(jù)提示，IGF-1具有心肌保護作用。然而，IGF-1是否可減輕供心低溫保存誘導的損傷還不明了。故本實驗將在大鼠心臟低溫保存模型上，觀察IGF-1是否可對抗低溫保存誘導心肌細胞凋亡和復灌期心功能下降，并探討其可能的機制。

材 料 和 方 法

1藥品與溶液的配制

IGF-1、LY294002和17-丙烯胺基-17-去甲氧基格爾德霉素(17-allylamino-17-demethoxy-geldanamycin，AAG)均購自Sigma。蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，又稱Akt)抗體、p-Akt (Ser473) 抗體、細胞色素氧化酶IV亞基(subunit IV of cytochrome oxidase，COXIV)抗體和β-actin抗體購自CST。其余試劑均為市售分析純級。Celsior液用于心臟的停搏與保存，其成分及含量為(mmol/L)：NaOH 100，KCl 15，MgCl213，CaCl20.25，甘露醇 60，乳酸鈉 80，組氨酸30，谷胱甘肽20，pH 7.4，滲透壓320 mOsm/L。

2動物

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(230～250 g)由浙江大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。根據(jù)保存液成分的不同，隨機分為7大組(n=8)。(1)空白對照(control)組：離體心臟不給予低溫保存處理；(2)單純Celsior組：離體心臟于Celsior液中4 ℃保存9 h；(3)IGF-1組：離體心臟于含10 nmol/L IGF-1的Celsior液中4 ℃保存9 h；(4)IGF-1+LY組：離體心臟于含10 nmol/L IGF-1和15 μmol/L LY294002的Celsior液中4 ℃保存9 h；(5)LY組：離體心臟于含15 μmol/L LY294002的Celsior液中4 ℃保存9 h；(6)IGF-1+AAG組：離體心臟于含10 nmol/L IGF-1和AAG(200 nmol/L)的Celsior液中4 ℃保存9 h；(7)AAG組：大鼠離體心臟于含AAG(200 nmol/L)的Celsior液中4 ℃保存9 h。

3離體鼠心灌流、低溫保存和心功能測定

SD大鼠用戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔麻醉后，迅速取出心臟，置于4 ℃ K-H液中除去血液，然后迅速轉(zhuǎn)移并固定于Langendorff灌流裝置上，用改良K-H液行常規(guī)逆行恒壓灌注(76 mmHg)，改良K-H液成分為(mmol/L)：NaCl 118，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgSO41.2，NaHCO325，CaCl21.25，葡萄糖 10，pH 7.4。整個灌注期間溫度保持在37 ℃，灌流液用95% O2、5% CO2飽和。切開左心耳，將連有壓力傳感器的球囊送入左心室，壓力傳感器和MedLab生物信號采集處理系統(tǒng)(南京美易)連接。待離體鼠心收縮逐漸穩(wěn)定后，往心室球囊內(nèi)緩慢注入適量生理鹽水，使左心室舒張末期壓維持在6～8 mmHg。K-H液平衡灌注30 min后，改用4 ℃的Celsior液灌注，灌注時間控制在3 min以內(nèi)，此時心臟表面同時降溫，待心臟停搏后，各組心臟置于含不同添加劑的Celsior心肌保存液中。在4 ℃條件下保存9 h后，重新置于Langendorff裝置上再灌注60 min。灌注條件同保存前保持一致。再灌注開始后的前10 min作為心臟復蘇后的穩(wěn)定期，測定再灌注60 min時左心室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure，LVDP)。

4心肌細胞凋亡指數(shù)

利用原位末端標記法(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)測定心肌細胞凋亡情況。切取左室心尖部全層心肌，10 %甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片。將組織切片用二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，37 ℃下用蛋白酶K處理30 min后再用PBS沖洗；0.3% H2O2甲醇溶液室溫下孵育30 min，PBS沖洗后加入FITC熒光標記的核苷酸和脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)的混合液，37 ℃水浴箱中反應60 min，PBS沖洗；加辣根過氧化物酶孵育30 min(37 ℃)，PBS沖洗；DAB顯色(避光)，蘇木素復染后脫水，透明，封片。在高倍鏡下檢測，心肌凋亡陽性細胞核呈棕黃色，凋亡陰性細胞核呈藍色。以凋亡陽性細胞數(shù)目占總心肌細胞數(shù)目的百分比作為心肌細胞凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。

5Westernblotting分析

取左心室在冰上加裂解液(含有0.1% PMSF，0.1% 蛋白抑制劑 cocktail，1% 聚乙二醇辛基苯基醚，0.1% 十二烷基硫酸鈉，10% 甘油，50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl)裂解制備勻漿液，離心取蛋白沉淀。Lowry法測蛋白濃度。取20 μg蛋白于10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。然后，5%脫脂奶粉封閉硝酸纖維素膜1 h，洗膜后加入I抗(1∶1 000)，4 ℃反應過夜。次日洗膜后，加入1∶2 500辣根過氧化物酶標記的II抗，室溫孵育1 h。加入ECL顯色劑，X片顯影。用Quality One圖像分析軟件(Bio-Rad)，根據(jù)吸光度定量分析。

6心肌線粒體的制備

采用差速分級離心法分離線粒體。將離體大鼠心臟置于預冷的勻漿介質(zhì)(160 mmol / L KC1，10 mmol/L EDTA，0.5%牛血清白蛋白，pH 7.4)中盡快剪碎，用組織勻漿機制成10%勻漿，在4 ℃下，以1 000×g離心10 min，棄沉淀，上清液于4 ℃、8 000×g離心10 min；棄上清液，沉淀用重懸液(320 mmol/L蔗糖，10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4)重懸后再次于4 ℃、8 000×g離心10 min。所得沉淀即為線粒體。線粒體置于重懸液中用考馬斯亮藍蛋白測定法測定蛋白含量。

7線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔的檢測

用線粒體緩沖液{120 mmol/L KCl，20 mmol/L 3-(N-嗎啉基)丙磺酸[3-(N-morpholino) propane sulfonic acid，MOPS]，10 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L KH2PO4，pH 7.4}將心肌線粒體稀釋至0.25 g/L 蛋白質(zhì)濃度。隨后加入200 μmol/L CaCl2，觀察CaCl2加入前后520 nm處線粒體吸光度(A520)的下降情況。用A520max-A520min的差值表示線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的開放情況。當MPTP開放時，線粒體通透性增加，腫脹液中的溶質(zhì)內(nèi)流入線粒體基質(zhì)，引起線粒體膨脹，外膜破裂，從而使得線粒體體積增大，520 nm處的吸光度下降明顯，A520max-A520min的差值增大。

8統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1IGF-1對低溫保存心臟心肌凋亡和心功能恢復情況

實驗前各組LVDP無明顯差異(數(shù)據(jù)未顯示)。心臟低溫保存9 h后，LVDP 恢復率明顯下降(34.6%±6.2%vs97.3%±3.7%，P<0.01)，細胞凋亡指數(shù)明顯增加(42.1%±4.4%vs3.4%±1.3%，P<0.01)，A520max-A520min差值增大(0.018±0.002vs0.010±0.003，P<0.01)。與單純Celsior組相比，在保存液中添加10 nmol/L IGF-1后，LVDP恢復率明顯增高，細胞凋亡指數(shù)明顯下降，A520max-A520min差值減小(P<0.01)，見圖1。

圖1心臟低溫保存9h再灌注60min后心臟LVDP恢復率、心肌凋亡和MPTP孔開放情況

2PI3K/Akt在IGF-1對抗低溫保存心肌損傷中的作用

與單純Celsior組相比，IGF-1組Akt蛋白總量無明顯變化，但其磷酸化水平增加約2.7倍(P<0.01)，見圖2。與IGF-1組相比，在低溫保存液中同時添加IGF-1和PI3K特異性抑制劑15 μmol/L LY294002后，心肌Akt磷酸化水平下降(P<0.01)，見圖2，且再灌注期心功能的恢復率下降，細胞凋亡指數(shù)增加(P<0.01)，見圖1。

圖2IGF-1對低溫保存心臟總Akt表達和磷酸化水平的影響

3IGF-1處理不同時間后對線粒體Akt總量的影響

與單純Celsior冷保存3、6和9 h組相比，在低溫保存液中添加IGF-1各組全細胞Akt總量沒有明顯變化；但線粒體Akt總量明顯增高(P<0.05)，見圖3。

圖3IGF-1處理不同時間后全細胞和線粒體內(nèi)Akt總量的變化

4熱休克蛋白90(heat-shockprotein90,HSP90)在IGF-1誘導的Akt磷酸化中的作用

與單純Celsior組相比，在低溫保存液中單獨添加HSP90特異性抑制劑AAG，心功能恢復率和細胞凋亡指數(shù)無明顯變化，見圖1。但AAG可明顯抑制IGF-1誘導的線粒體Akt總量和磷酸化水平增加(P<0.01)，而對胞漿內(nèi)Akt磷酸化水平無明顯影響，見圖4。與IGF-1組相比，IGF-1+AAG組心臟再灌注期心功能的恢復率下降，細胞凋亡指數(shù)增加(P<0.01)，見圖1。

圖4Westernblotting檢測心肌細胞胞漿和線粒體中總Akt表達和磷酸化水平的變化

討 論

研究表明，隨著低溫保存時間的延長，供心在再灌注期的心臟收縮功能明顯下降，且心肌細胞凋亡的發(fā)生率也明顯增加[6]。有效對抗低溫缺血保存后再灌注損傷，促進供心心功能的恢復是心臟移植成功的關鍵。IGF-1是維持正常心功能的重要的生理性調(diào)節(jié)因子。流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，低水平的血清IGF-1水平與急性心肌梗死、缺血性心肌病、冠脈粥樣硬化等的發(fā)生密切相關；而臨床研究發(fā)現(xiàn)補充IGF-1可明顯改善充血性心衰患者的心功能。動物實驗也表明IGF-1可具有改善糖尿病心肌病、心衰和心肌梗死等作用[3-5]。最近研究報道，IGF-1可減輕缺氧誘導的心肌細胞凋亡[7]。我們的實驗發(fā)現(xiàn)，在保存液中添加IGF-1同樣可減少低溫保存誘導的心肌細胞凋亡的發(fā)生，提高再灌注期心功能的恢復率。提示，IGF-1在心臟低溫保存模型上同樣具有保護作用。研究證實，MPTP開放是各種因素刺激心肌細胞線粒體凋亡途徑的關鍵。本研究發(fā)現(xiàn)IGF-1可改善低溫保存誘導的MPTP開放情況，提示IGF-1的心肌保護作用機制可能與其抑制MPTP開放有關。

IGF-1減輕低溫保存誘導的心肌細胞凋亡的確切機制尚不明了。近年來的研究表明IGF-1可能通過多條信號轉(zhuǎn)導機制發(fā)揮其保護作用，而PI3K/Akt的激活在其中起了關鍵的作用。已經(jīng)證實，PI3K/Akt激活后可調(diào)節(jié)細胞多種功能，其中包括促生存、抗凋亡和自噬、調(diào)節(jié)蛋白合成和糖代謝、改善線粒體能量代謝、正性肌力作用等[7-9]。本實驗發(fā)現(xiàn)， IGF-1可上調(diào)低溫保存心臟Akt蛋白磷酸化水平，在低溫保存液中添加PI3K特異性抑制劑LY294002不僅降低了IGF-1誘導的Akt磷酸化水平，且可取消IGF-1促進低溫保存心臟心功能的恢復和抗凋亡作用。提示，PI3K/Akt在IGF-1抗低溫保存誘導的心肌損傷中起了關鍵的作用。

以往的研究認為Akt大部分存在于胞漿中，極少量存在于細胞核中。2003年，Bijur等[10]首次報道Akt蛋白也可存在于神經(jīng)細胞線粒體上；且在PI3K刺激下胞漿Akt蛋白可發(fā)生磷酸化激活，并迅速轉(zhuǎn)位至線粒體。此后，Akt被報道同樣存在于心肌細胞線粒體上[11]。我們的研究發(fā)現(xiàn)IGF-1對細胞總Akt含量不變，但胞漿和線粒體Akt蛋白磷酸化程度均明顯增加。Ahmad等[12]在小鼠心臟缺血再灌注模型中發(fā)現(xiàn)，僅僅激活胞漿中的Akt不足以引發(fā)心肌保護作用，而磷酸化的Akt從胞漿轉(zhuǎn)位至線粒體是引發(fā)心肌保護作用的關鍵。Akt線粒體轉(zhuǎn)位誘導的抗凋亡作用分子機制還不明了。根據(jù)文獻報道推測，Akt線粒體轉(zhuǎn)位后可能主要通過以下3條途徑維持線粒體的完整性[13]，對抗低溫保存誘導的心肌細胞損傷：(1)磷酸化Bad和Bax，抑制Bax向線粒體移位，從而調(diào)節(jié)MPTP開放；(2)使糖原合成酶激酶3的Ser9和Ser21位點磷酸化激活，抑制其活性，阻止MPTP開放；(3)激活線粒體己糖激酶II，抑制其從線粒體分離，從而減少MPTP開放。但具體機制仍需進一步實驗證實。

雖然已經(jīng)證實Akt線粒體轉(zhuǎn)位具有抗凋亡作用，但IGF-1誘導Akt線粒體轉(zhuǎn)位的分子機制仍不明了。HSP90是熱休克蛋白家族最典型的成員之一。早在2000年Sato等[14]就報道了Akt作為一種典型的“雇主”蛋白受HSP90所調(diào)控。HSP90是維持Akt結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定的關鍵因子，HSP90抑制劑可誘導Akt去磷酸化。而最近的研究證實，HSP90作為一種伴侶分子在參與蛋白線粒體轉(zhuǎn)位中也起了關鍵的作用[15]。本實驗結(jié)果顯示，HSP90抑制劑可降低IGF-1誘導的線粒體Akt總量和磷酸化水平，但對IGF-1誘導的胞漿Akt磷酸化水平并無明顯影響，且HSP90抑制劑可取消IGF-1的心肌保護作用，提示Akt可能通過HSP90依賴性模式完成線粒體轉(zhuǎn)位。

綜上所述，在低溫保存液中添加IGF-1可明顯降低心肌細胞凋亡的發(fā)生，促進再灌注期心功能的恢復。IGF-1的心肌保護機制可能與HSP90依賴性Akt激活和線粒體轉(zhuǎn)位有關。

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Heat-shockprotein90-dependenttranslocationofAkttomitochondriamediatesinsulin-likegrowthfactor1-inducedprotectionofratheartsunderhypothermicpreservation

YU Guo-wei1, CHEN Jie2, CHEN Ying-ying2, ZHENG Ming-zhi3, SHEN Yue-liang2

(1DepartmentofCardiothoracicSurgery,theFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofPathologyandPathophysiology,ZhejiangUniversitySchoolofMedicine,Hangzhou310058,China;3DepartmentofPharmacology,ZhejiangMedicalCollege,Hangzhou310053,China.E-mail:shenyueliang@zju.edu.cn;zmzjjpdd181@sina.com)

AIM: To investigate the effect of insulin-like growth factor 1 (IGF-1) on hypothermic preservation of rat hearts.METHODSIsolated rat hearts were preserved in Celsior solution with or without IGF-1 (10 nmol/L) for 9 h, followed by 60 min of reperfusion. Cell apoptosis was assessed by TUNEL method. The left ventricular developed pressure (LVDP) was recorded. Total Akt protein and phosphorylation of Akt protein were detected by Western blotting.RESULTSCompared with Celsior solution preservation group, IGF-1 significantly enhanced the LVDP recovery rate, decreased the apoptotic index, and inhibited the opening of mitochondrial permeability transition pore. IGF-1 increased the phosphorylation of Akt in 9 h of hypothemically preserved rat heart, which was inhibited by PI3K inhibitor LY294002. LY294002 also abolished the cardioprotection of IGF-1. 17-Allylamino-17-demethoxy-geldanamycin, a heat-shock protein 90 (HSP90) inhibitor, inhibited the IGF-1-induced increase in phosphorylation level of Akt and transolation to mitochondria, the improvement of cardiac functions, and the decrease in apoptosis.CONCLUSIONIGF-1 improves the cardiac functions and decreases apoptosis in the hearts under hypothermic preservation. The mechanism might involve in HSP90-dependent translocation in Akt to mitochondria.

Heart preservation; Insulin-like growth factor 1; Akt; Heat-shock proteins 90; Mitochondria

R331

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.10.008