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慢病毒介導(dǎo)的c-met RNA干擾對人乳頭狀甲狀腺癌K1細(xì)胞生物學(xué)行為的影響*

2012-07-31 14:06鄭時玉劉澤兵
中國病理生理雜志 2012年10期
關(guān)鍵詞:乳頭狀細(xì)胞周期甲狀腺癌

鄭時玉,王 麗,劉澤兵,桂 律

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院病理科,上海 201508)

c-Met是由c-met原癌基因編碼的具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體,與其配體肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)結(jié)合后,發(fā)生自身磷酸化,進(jìn)而通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo),導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生各種生物學(xué)反應(yīng)[1]。已有不少研究證實(shí)c-Met在乳頭狀甲狀腺癌中高表達(dá),并與其病理分期、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。RNA 干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)是近年來發(fā)展起來的新技術(shù),它能介導(dǎo)序列高度同源的靶基因的mRNA降解,從而特異而有效地阻斷靶基因的表達(dá)。而慢病毒介導(dǎo)的RNAi具有對分裂和非分裂細(xì)胞均有感染作用、容納外源性基因片段大、感染后可以整合到受感染細(xì)胞的基因組進(jìn)行長時間的穩(wěn)定表達(dá)等特點(diǎn)。本研究旨在探討慢病毒RNAi載體阻斷HGF/c-Met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后對乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞生長、遷移、侵襲等的作用。

材料和方法

1 材料

Lipofectamine 2000購自Invitrogen;SuperReal PreMix(SYBR Green)購自天根生化;β-actin和c-Met I抗購自Santa Cruz;羊抗兔、羊抗鼠Ⅱ抗購自優(yōu)寧維公司;Transwell小室購自 Corning;DMEM/F12購自HyClone;BALB/c裸鼠購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

2 方法

2.1 免疫組化 檢測組織取自2007年~2009年間在復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院實(shí)施手術(shù)切除的35例乳頭狀甲狀腺癌標(biāo)本和25例良性甲狀腺疾病標(biāo)本(包括甲狀腺腺瘤10例、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫15例)。標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定。免疫組化檢測用EnVision二步法,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,PBS緩沖液代替I抗作為陰性對照。

2.2 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng) 人乳頭狀甲狀腺癌K1細(xì)胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬二院提供,并常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中;培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。

2.3 RNAi慢病毒載體的制備 根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則及人類 met基因 mRNA序列(GenBank_id NM_001127500)設(shè)計(jì)了2條針對met基因的RNAi靶點(diǎn)序列,即 c-met1:GCACGATGAATACATTGAAAT,c-met2:TCAACTTCTTTGTAGGCAATA。針對靶位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)2條互補(bǔ)的寡核苷酸序列,將合成好的單鏈DNA退火形成雙鏈DNA Oligo,與經(jīng)Age I和EcoR I雙酶切回收好的PGCSIL-GFP載體連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑選陽性重組菌落送上海吉凱基因測序。

2.4 RNAi慢病毒包裝及滴度測定 用 Lipofectamine 2000將3種質(zhì)粒(PGCSIL-GFP、pHelper 1.0和pHelper 2.0)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后,收集富含慢病毒顆粒的上清液,采用逐孔稀釋法測定慢病毒滴度。

2.5 慢病毒感染 K1細(xì)胞 慢病毒以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為50感染細(xì)胞,加入Polybrene至終濃度為5 mg/L;96 h后,熒光顯微鏡下觀察感染效率,繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。

2.6 實(shí)時熒光定量PCR 采用SYBR Green法,cmet上游引物 5’-TCTGCCTGCAATCTACAAGG-3’,下游引物 5’-ATTATTCCTCCGAAATCCAAAGT-3’;β-actin上游引物5’-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3’,下游引物5’-CGTGGATGCCACAGGACT -3’。

2.7 Western blotting 用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,I抗稀釋為1∶200,Ⅱ抗稀釋為1∶3000。

2.8 克隆形成實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞以200 cells/well接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng),連續(xù)培養(yǎng)14 d,經(jīng)固定、結(jié)晶紫染色后,記錄含有50個細(xì)胞以上的克隆數(shù)量。

2.9 流式細(xì)胞術(shù)測量細(xì)胞周期 用胰酶消化細(xì)胞,離心沉淀,再用預(yù)冷的PBS混懸細(xì)胞,離心沉淀,加入70%乙醇4℃固定24 h,再次離心沉淀,每管加入碘化丙啶染色液,染色完成后24 h內(nèi)用流式細(xì)胞術(shù)檢測。

2.10 劃痕實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞以5×104cells/well的密度接種于24孔板中,待接近形成細(xì)胞單層時,用200 μL的槍頭在24孔板內(nèi)均勻劃直線,更換含1%FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

2.11 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 采用 24孔 Transwell(8.0 μm濾膜微孔孔徑)系統(tǒng)。小室內(nèi)加入40 μL基質(zhì)膠(matrigel)(1∶4稀釋),用含 0.5%BSA 的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×108cells/L,取200 μL細(xì)胞懸液加入小室內(nèi),下室加入1000 μL含10%FBS的培養(yǎng)基,常規(guī)培養(yǎng)24 h。用棉簽擦去小室上表面的細(xì)胞,固定,結(jié)晶紫染色。

2.12 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn) 將18只6周齡BALB/c雌性裸鼠隨機(jī)分為空白對照組、陰性對照組和RNA干擾組,每組6只,飼養(yǎng)在上海市公共衛(wèi)生動物中心;選用沉默效果最佳的K1-cmet-sh2進(jìn)行實(shí)驗(yàn);將3組細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸為密度1×1010/L的懸液,在裸鼠腋窩中部外側(cè)皮下注射0.2 mL的細(xì)胞懸液。接種后,定期觀察各組成瘤情況,腫瘤體積計(jì)算公式:(長×寬2)/2。接種30 d后斷頸處死裸鼠,從皮下剝離出腫瘤組織。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行率的比較;計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間差異顯著性檢驗(yàn)采用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 免疫組化結(jié)果

c-Met蛋白染色定位于甲狀腺細(xì)胞的細(xì)胞漿,見圖1,陽性為棕黃色顆粒。根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比大致分為:陰性(-),未發(fā)現(xiàn)陽性瘤細(xì)胞;弱陽性(+),陽性細(xì)胞≤5%;中陽性(++),陽性細(xì)胞5%~20%;強(qiáng)陽性(+++),陽性細(xì)胞>20%。其中將陰性(-)及弱陽性(+)歸為低表達(dá)組,中陽性(++)及強(qiáng)陽性(+++)歸為高表達(dá)組[3]。乳頭狀甲狀腺癌c-Met蛋白表達(dá)明顯高于良性甲狀腺病(P<0.05),見表1。

2 重組慢病毒載體測序結(jié)果

將重組慢病毒載體分別命名為PGC-met1-shRNA、PGC-met2-shRNA和PGC-NC-shRNA,其中PGC-NC-shRNA由上海吉凱基因提供。結(jié)果顯示根據(jù)RNAi靶位合成的雙鏈DNA核苷酸序列成功插入PGCSIL-GFP載體質(zhì)粒的Age I和EcoR I的酶切位點(diǎn),說明c-met RNAi載體構(gòu)建成功,見圖2。

Figure 1.The expression of c-Met protein detected by immunochemistry(×200).A:papillary thyroid cancer;B:benign thyroid disease.圖1 免疫組化檢測乳頭狀甲狀腺癌中c-Met的表達(dá)

表1 c-Met在乳頭狀甲狀腺癌與良性甲狀腺病變中的表達(dá)情況Table 1.The expression of c-Met in papillary thyroid carcinoma and benign thyroid disease

Figure 2.The sequence maps of the recombinant plasmids.圖2 重組質(zhì)粒測序圖譜片段

3 重組慢病毒感染K1細(xì)胞的效率

將細(xì)胞分為4組:K1-CON(空白對照組即未感染慢病毒的細(xì)胞)、K1-NC(陰性對照組即感染PGC-NC-shRNA慢病毒的細(xì)胞)、K1-cmet-sh1(感染PGC-met1-shRNA慢病毒的細(xì)胞)和K1-cmet-sh2(感染PGC-met2-shRNA慢病毒的細(xì)胞)。重組慢病毒(MOI=50)感染K1細(xì)胞96 h后,熒光顯微鏡下觀察綠色熒光,見圖3,結(jié)果顯示K1-NC、K1-cmet-sh1和K1-cmet-sh2組慢病毒的感染效率分別為93.3%、92.5%和89.5%。

Figure 3.GFP expression examined using fluorescent microscopy(×40).圖3 熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞GFP表達(dá)情況

4 重組慢病毒感染K1細(xì)胞后c-met mRNA和蛋白表達(dá)

慢病毒感染細(xì)胞96 h后,分別用熒光定量PCR及Western blotting檢測各組細(xì)胞c-met mRNA及蛋白表達(dá)情況,以β-actin為內(nèi)參照。熒光定量PCR采用2-ΔΔCt法計(jì)算 c-met mRNA 的相對表達(dá)量,結(jié)果見圖4。K1-cmet-sh1和K1-cmet-sh2組細(xì)胞c-met mRNA水平與 K1-NC組相比分別下降65.8%和81.7%,K1-cmet-sh1組與 K1-NC組比較、K1-cmet-sh2組與K1-NC組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而K1-NC組與K1-CON組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Figure 4.The effect of c-met RNAi lentivirus on c-met mRNA expression in K1 cells..n=3.*P<0.05 vs K1-CON or K1-NC.圖4 c-met RNAi慢病毒對K1細(xì)胞c-met mRNA表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果見圖5。K1-cmet-sh1和K1-cmet-sh2組細(xì)胞c-Met蛋白水平與K1-NC組相比分別下降40.6%和69.3%,K1-cmet-sh1組與K1-NC組比較、K1-cmet-sh2組與K1-NC組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而K1-NC組與K1-CON組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。熒光定量PCR及Western blotting結(jié)果都表明重組慢病毒介導(dǎo)的RNAi能成功下調(diào)c-met表達(dá)。

Figure 5.The effect of c-met RNAi lentivirus on c-met protein expression in K1 cells.圖5 c-met RNAi慢病毒對K1細(xì)胞c-met蛋白表達(dá)的影響

5 重組慢病毒感染K1細(xì)胞后細(xì)胞克隆形成能力的變化

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6。顯微鏡下觀察計(jì)數(shù),記錄含有50個細(xì)胞以上的克隆數(shù),計(jì)算細(xì)胞克隆形成率,克隆形成率(%)=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù) ×100%。結(jié)果顯示 K1-cmet-sh2組(11.5% ±1.3%)的克隆形成率明顯小于K1-NC組(17.5% ±1.0%)和 K1 -CON 組(18.6% ±1.2%),K1 -cmet-sh2組較K1-NC組的克隆形成率降低34.3%,K1-cmet-sh2組與 K1-NC組、K1-cmet-sh2組與K1-CON組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。但K1-NC組與K1-CON組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Figure 6.The effect of c-met RNAi lentivirus on colony formation activity of K1 cells.圖6 c-met RNAi慢病毒對K1細(xì)胞克隆形成能力的影響

6 重組慢病毒感染K1細(xì)胞后細(xì)胞周期的改變

K1-cmet-sh2組 S期細(xì)胞(19.53% ±2.56%)較 K1-CON 組(40.85% ±5.56%)和 K1-NC組(36.75% ±5.32%)都有所較少,且有顯著差異(P<0.05),而 K1-CON 組(40.85% ±5.56%)與 K1-NC組(36.75% ±5.32%)相比無明顯差異(P>0.05),見圖 7。

Figure 7.The effect of c-met RNAi lentivirus on cell cycle of K1 cells.圖7 c-met RNAi慢病毒對K1細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

7 重組慢病毒感染K1細(xì)胞后細(xì)胞遷移能力的改變

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8。分別測量0 h和48 h的劃痕寬度,平均遷移距離=(0 h的劃痕寬度-48 h的劃痕寬度)/2。結(jié)果顯示 K1-cmet-sh2組[(146.2±16.6)μm]平均遷移距離小于 K1-NC 組[(210.8±19.7)μm]和 K1 -CON 組[(213.6 ±20.2)μm],K1-cmet-sh2組較K1-NC組的平均遷移距離減少30.6%,K1-cmet-sh2組與K1-NC組、K1-cmet-sh2組與K1-CON組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但K1-NC組與K1-CON組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Figure 8.The effect of c-met RNAi lentivirus on migrative activity of K1 cells(×40).圖8 c-met RNAi慢病毒對K1細(xì)胞遷移能力的影響

8 重組慢病毒感染K1細(xì)胞后細(xì)胞侵襲能力的改變

倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)穿過濾膜的細(xì)胞數(shù),隨機(jī)計(jì)數(shù)5個視野,Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9,結(jié)果顯示 K1-cmet-sh2組[(11.4±1.9)個]細(xì)胞數(shù)明顯小于K1-NC組[(16.4±1.9)個]和K1-CON組[(17.2±2.1)個],K1-cmet-sh2組較 K1-NC 組的遷移細(xì)胞數(shù)減少30.5%,K1-cmet-sh2組與K1-NC組、K1-cmet-sh2組與K1-CON組兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但K1-NC組與K1-CON組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Figure 9.The effect of c-met RNAi lentivirus on invasive activity of K1 cells(×100).圖9 c-met RNAi慢病毒對K1細(xì)胞侵襲能力的影響

9 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)

接種8 d后陰性對照組可見腫瘤長出,接種20 d后RNAi組見腫瘤長出。接種30 d后將裸鼠處死,見圖10。RNAi組的腫瘤體積[(35.0 ±3.2)mm3]明顯小于陰性對照組[185.0±12.6)mm3](P <0.05)。

Figure 10.The effect of c-met RNAi lentivirus on the tumor growth of subcutaneous implantation in the nude mice.圖10 c-met RNAi慢病毒對裸鼠皮下抑制瘤生長的影響

討 論

乳頭狀甲狀腺癌是甲狀腺癌中最常見的類型,青少年、女性多見,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較早,雖然絕大多數(shù)病人經(jīng)手術(shù)、放射碘等治療后預(yù)后較好,但仍有少數(shù)病人會發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,因此尋找一種新的治療方法已成為一個重要課題。而慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾就是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù),能特異而有效、穩(wěn)定地阻斷靶基因的表達(dá)。

c-Met是具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體,它與HGF結(jié)合后,胞內(nèi)區(qū)發(fā)生自身磷酸化,從而激活下游的PI3K/AKT、MEK/MAPK信號通路,導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生增殖、侵襲等生物學(xué)反應(yīng)[4-6]。c-Met在不同的腫瘤中可以以點(diǎn)突變、基因移位、基因擴(kuò)增、過度表達(dá)、和HGF形成自分泌環(huán)等方式發(fā)揮作用,引起促腫瘤細(xì)胞增殖、抗凋亡、促侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。已有不少研究證實(shí)c-Met在乳頭狀甲狀腺癌中高表達(dá),并與其病理分期、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此猜測c-Met參與了甲狀腺癌發(fā)生與發(fā)展的過程,理論上阻斷腫瘤細(xì)胞c-Met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路就有可能減低細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等能力從而抑制腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。而目前國內(nèi)尚未見慢病毒介導(dǎo)的c-met RNAi的用于甲狀腺癌方面的研究。

克隆形成能力反映細(xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個重要特征,更傾向于反映腫瘤細(xì)胞的“接觸不抑制”特征[7],是反映腫瘤惡性程度的手段。張盛周等[8]用腺病毒介導(dǎo)c-met RNAi后抑制了肝癌細(xì)胞的克隆形成能力。在本實(shí)驗(yàn)中我們應(yīng)用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測了下調(diào)c-met后細(xì)胞克隆形成能力的變化,結(jié)果顯示細(xì)胞的克隆形成能力減低。

姬長友等[9]下調(diào) c-met后,喉癌 Hep-2細(xì)胞的遷移侵襲能力降低;Wang等[10]下調(diào)肺小細(xì)胞癌SCLC細(xì)胞的c-met后,細(xì)胞遷移侵襲能力減低;Chu等[11]下調(diào)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的 c-met后,細(xì)胞侵襲能力也減低。由此我們推測下調(diào)甲狀腺癌細(xì)胞c-met后細(xì)胞的遷移侵襲能力也將會有所減低。在本實(shí)驗(yàn)中,我們運(yùn)用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測體外細(xì)胞的遷移侵襲能力,而Transwell小室是目前最為理想的模擬體外細(xì)胞侵襲的模型,結(jié)果顯示下調(diào)c-met后細(xì)胞的遷移侵襲能力都降低,與我們之前預(yù)測的相符。

細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的紊亂是腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要因素。細(xì)胞周期主要由細(xì)胞周期素和細(xì)胞周期依賴性激酶形成的復(fù)合物進(jìn)行調(diào)節(jié),此復(fù)合物的激活和失活可調(diào)控細(xì)胞周期不同時期之間的轉(zhuǎn)換,其中G1-S和G2-M期的轉(zhuǎn)換為2個關(guān)鍵的檢查點(diǎn)[12]。許多基因的突變或失活均可導(dǎo)致細(xì)胞周期的失調(diào)。在本實(shí)驗(yàn)中,我們運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期,結(jié)果顯示 c-met下調(diào)后,細(xì)胞周期的進(jìn)程減慢。

為了證實(shí)細(xì)胞在體內(nèi)的生長狀況,我們將cmet下調(diào)后的細(xì)胞接種到裸鼠體內(nèi),觀察其對K1細(xì)胞成瘤能力的影響,結(jié)果顯示c-met下調(diào)后的細(xì)胞在裸鼠皮下的成瘤能力降低。

綜上所述,通過慢病毒介導(dǎo)的RNAi可以有效降低甲狀腺癌K1細(xì)胞c-met的表達(dá),這種c-met的下調(diào)能夠抑制細(xì)胞的克隆形成、細(xì)胞周期進(jìn)程、遷移侵襲能力和成瘤能力,由此推測,c-met可能成為未來診斷和治療甲狀腺癌的潛在靶點(diǎn),這也為臨床上對乳頭狀甲狀腺癌進(jìn)行基因治療提供了理論依據(jù)。

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知母皂苷AⅢ對白血病細(xì)胞HL-60增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響及機(jī)制探討
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SUMO4在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及臨床意義
乳頭狀汗管囊腺癌一例
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