榮書玲，王庸晉△，王曉林，趙俊青，賀小峰，胡耀東，劉麗云

(長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院1心內(nèi)科，2兒科，3康復(fù)科，4信息科，山西 長(zhǎng)治 046000)

細(xì)胞移植是近年來治療心力衰竭的一個(gè)全新策略。成肌細(xì)胞作為骨骼肌的前體細(xì)胞具有以下優(yōu)勢(shì)而作為細(xì)胞移植的候選細(xì)胞之一:自體來源，取材方便，易于在體外擴(kuò)增，只向肌纖維細(xì)胞分化，對(duì)缺血耐受力大，植入自體不引起排斥反應(yīng)［1］。但細(xì)胞移植由于移植細(xì)胞的生存率低而影響了治療效果。胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin like growth factor 1，IGF－1)是人體內(nèi)的一種重要的細(xì)胞因子。它具有廣泛的生物學(xué)活性［2］，它可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化，還可以抑制細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)局部血管化，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等生物活性［2－3］。因此，IGF－1成為基因治療某些疾病的理想靶點(diǎn)。如果用IGF－1基因修飾的成肌細(xì)胞移植改善受損的心功能，一方面，骨骼肌成肌細(xì)胞能替代壞死的心肌細(xì)胞發(fā)揮收縮功能，另一方面，IGF－1基因修飾的成肌細(xì)胞分泌的IGF－1可以改善病損部位的微環(huán)境，通過多種途徑抑制移植細(xì)胞的凋亡，從而進(jìn)一步改善受損的心功能。因此，本研究首先探討了IGF－1基因修飾的骨骼肌成肌細(xì)胞對(duì)成肌細(xì)胞缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡的影響，為下一步將IGF－1基因修飾的成肌細(xì)胞移植到受損心肌改善心功能奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 動(dòng)物

新生SD大鼠的乳鼠(1～3 d)由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(鄂)2004－0007，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合2006年科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定［4］。

2 主要試劑

DMEM液體培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco;Desmin抗體購(gòu)自Sigma，轉(zhuǎn)染試劑Poly－brene購(gòu)自Sigma;pLghIGF－1SN和pLgGFPSN質(zhì)粒由華中科技大學(xué)盧永昕教授惠贈(zèng)，PT67包裝細(xì)胞購(gòu)自Clontech，E86包裝細(xì)胞購(gòu)自ATCC，F(xiàn)ugene6轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Roche，兔抗人IGF－1單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，人IGF－1 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自 R＆D，Trizol RNA提取試劑盒購(gòu)自 Gibco－BRL，原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)盒購(gòu)自Roche，RT－PCR試劑盒購(gòu)自Invitrogen，其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1 成肌細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定和轉(zhuǎn)染 鼠骨骼肌成肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)按照以前描述的方法［5］。培養(yǎng)瓶的底部放人無菌的蓋玻片，成肌細(xì)胞生長(zhǎng)3～4 d后，取出蓋玻片，PBS洗2次，冷丙酮固定，按常規(guī)SP染色方法進(jìn)行Desmin免疫組化染色的檢測(cè)。

3.2 基因轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞 PT67包裝細(xì)胞用含100 mL/L胎牛血清DMEM培養(yǎng)，E86包裝細(xì)胞用含100 mL/L小牛血清DMEM培養(yǎng)。分別將攜帶人胰島素樣生長(zhǎng)因子1(human insulin－like growth factor 1，hIGF－1)基因的pLghIGF－1SN質(zhì)粒和攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因的對(duì)照質(zhì)粒pLgGFPSN，用二步轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染E86和PT67包裝細(xì)胞，G418篩選并擴(kuò)增陽(yáng)性細(xì)胞克隆。收集病毒液用0.45 μm的濾器過濾后凍存于－80℃的冰箱。

將純化的成肌細(xì)胞傳代到不同的培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿到約70%時(shí)，吸去培養(yǎng)液，分別取含pLgGFPSN和pLghIGF－1SN的病毒上清及polybrene的混合液，培養(yǎng)過夜，第2 d吸去病毒液，換用成肌細(xì)胞的正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后在共聚焦顯微鏡下觀察其綠色熒光的強(qiáng)度，換用含G418的培養(yǎng)基篩選并擴(kuò)增陽(yáng)性克隆。

3.3 基因在成肌細(xì)胞的表達(dá)

3.3.1 免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定基因在成肌細(xì)胞的表達(dá)人IGF－1蛋白在成肌細(xì)胞中的表達(dá)采用免疫組織化學(xué)方法。所用Ⅰ抗為兔抗人IGF－1單克隆抗體(1∶100)，Ⅱ抗為生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，Ⅲ抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的卵白素，DAB顯色液顯色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1936年2月，紅二、六軍團(tuán)幫助大定八堡建立苗族獨(dú)立團(tuán)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，“紅軍幫助黔西北各族人民共建立了95個(gè)游擊團(tuán)，”[17]在貓山、松桃建立了苗民游擊隊(duì)。紅軍在貴州活動(dòng)中，還幫助各族人民建立蘇維埃政權(quán)。黔西北成立建川滇黔省革命委員會(huì)。在各級(jí)蘇維埃政權(quán)中，選拔培養(yǎng)了一批少數(shù)民族干部，“松桃甘龍區(qū)10個(gè)鄉(xiāng)蘇維埃有34位苗族干部，占干部總數(shù)的40%，”[18]P81-86嚴(yán)家坡革命委員會(huì)正副主席都是苗族。也正是因?yàn)樵诩t軍幫助下建立了不少少數(shù)民族武裝，從而在貴州幾乎形成了遍及省內(nèi)各地聲勢(shì)浩大的武裝斗爭(zhēng)怒潮。

3.3.2 RT－PCR檢測(cè)成肌細(xì)胞中 hIGF－1 mRNA表達(dá) 成肌細(xì)胞分3組，IGF組(轉(zhuǎn)入hIGF－1基因的細(xì)胞)，GFP組(轉(zhuǎn)入GFP基因的細(xì)胞)，control組(未轉(zhuǎn)染的成肌細(xì)胞)?；蜣D(zhuǎn)染成肌細(xì)胞后72 h，用Trizol RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，紫外光檢測(cè)樣品吸光度，A260/A280為1.8～2.0。應(yīng)用 RTPCR法(按照RT－PCR試劑盒說明操作)檢測(cè)成肌細(xì)胞中hIGF－1 mRNA的表達(dá)。引物設(shè)計(jì)，hIGF－1上游引物5’－ATGCACACCATGTCCTCCTCGCAT－3’，下游引物 5’－CTACATCCTGTAGTTCTTGTT－3’;GAPDH 上游引物 5’－TTCTTGTGCAGTGCCAGCCTCGTC－3’，下游引物5’－TAGGAACACGGAAGGCCATGCCAG－3’。以GAPDH作為內(nèi)參照進(jìn)行標(biāo)化。

3.4 ELISA法檢測(cè)hIGF－1表達(dá) 成肌細(xì)胞培養(yǎng)上清中hIGF－1濃度采用雙抗體一步夾心ELISA法檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒的操作說明進(jìn)行。從室溫平衡20 min后的鋁箔袋中取出所需板條，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL;待測(cè)樣本孔先加待測(cè)樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL;隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的hIGF－1抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板)。每孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度(A)值。計(jì)算樣品濃度。

3.5 IGF－1基因修飾成肌細(xì)胞對(duì)成肌細(xì)胞增殖的影響 取3組生長(zhǎng)良好，數(shù)目為2×106的成肌細(xì)胞，其中一組轉(zhuǎn)入IGF－1基因(IGF組)，另一組轉(zhuǎn)入GFP基因(GFP組)，未轉(zhuǎn)染的成肌細(xì)胞作為細(xì)胞對(duì)照(control組)，在轉(zhuǎn)染3～14 d用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分別計(jì)數(shù)3組細(xì)胞的數(shù)目，比較3個(gè)不同組中成肌細(xì)胞的增殖情況，觀察IGF－1基因轉(zhuǎn)染對(duì)成肌細(xì)胞增殖的影響。

3.6 IGF－1基因轉(zhuǎn)染對(duì)成肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的影響 基因轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞后7 d，IGF－1組和GFP組的成肌細(xì)胞用PBS洗滌2～3次，然后加入模擬的缺血液，在模擬缺血條件下(5%CO2、1%O2、94%N2、37℃培養(yǎng)箱中缺氧、缺糖)培養(yǎng)1 h，之后將模擬缺血液吸盡并加入正常DMEM(含胎牛血清)培養(yǎng)基，放至普通培養(yǎng)箱中(5%CO2、37℃)繼續(xù)培養(yǎng)6 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取出細(xì)胞爬片，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定30 min，用TUNEL法檢測(cè)成肌細(xì)胞凋亡，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，control組細(xì)胞作為正常對(duì)照。細(xì)胞顯色后，在光鏡下觀察凋亡陽(yáng)性細(xì)胞。計(jì)數(shù)5個(gè)200倍視野，以平均每100個(gè)細(xì)胞核中含凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)作為凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。

3.7 RT－PCR檢測(cè)IGF－1基因轉(zhuǎn)染對(duì)bax和bcl－2 mRNA表達(dá)的影響 缺血再灌注損傷后6 h，用Trizol RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，紫外光檢測(cè)樣品吸光度，A260/A280為1.8～2.0。應(yīng)用RT －PCR 法(按照RT－PCR試劑盒說明操作)檢測(cè)成肌細(xì)胞中bax和bcl－2 mRNA的表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參照進(jìn)行標(biāo)化。bax上游引物5’－GCAGAGGATGATTGCTGATG－3’，下游引物 5’－CTCAGCCCATCTTCTTCCAG － 3’;bcl－2:上游引物 5’－TCCATTATAAGCTGTCACAG－3’，下 游 引 物 5’ －GAAGAGTTCCTCCACCAC－3';GAPDH上游引物5’－TTCTTGTGCAGTGCCAGCCTCGTC－3’，下游引物5’－TAGGAACACGGAAGGCCATGCCAG －3’。

3.8 Western blotting檢測(cè) IGF－1基因轉(zhuǎn)染對(duì)caspase－3活化的影響 缺血再灌注損傷后6 h，用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解3組成肌細(xì)胞，15000 r/min離心30 min，吸取上清(可溶性蛋白)，并以BCA法定量總蛋白。然后進(jìn)行SDS－PAGE電泳，蛋白經(jīng)轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉2h，加入活化的caspase－3單抗4℃過夜，TBS－T(含0.05%Tween 20的TBS)洗滌，HRP－標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBS－T洗滌后應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法顯色，之后曝光顯影。采用Bio－Rad公司Quantity One分析軟件對(duì)顯影條帶進(jìn)行灰度分析，將目的蛋白與GAPDH灰度比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 成肌細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定

我們用攜帶hIGF－1基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染成肌細(xì)胞，G418篩選后免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)可見hIGF－1在成肌細(xì)胞中的表達(dá)，見圖1B。

Figure 1.Expression of desmin(A)and hIGF－1(B)in rat myoblasts detected by immunocytochemistry(×200).圖1 免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定desmin和hIGF－1在大鼠成肌細(xì)胞的表達(dá)

2 RT－PCR檢測(cè)成肌細(xì)胞中hIGF－1 mRNA表達(dá)

成肌細(xì)胞感染后72 h，RT－PCR檢測(cè)顯示，hIGF－1基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(IGF組)中有 hIGF－1 mRNA的表達(dá)，而GFP基因轉(zhuǎn)染的成肌細(xì)胞(GFP組)及未經(jīng)轉(zhuǎn)染的成肌細(xì)胞(control組)未見hIGF－1 mRNA的表達(dá)，見圖2。

Figure 2.Expression of hIGF － 1 mRNA in myoblasts.IGF:myoblasts transfected with pLghIGF－1SN;GFP:myoblasts transfected with pLgGFPSN;control:untransfected myoblasts..n=6.*P＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs GFP.圖2 成肌細(xì)胞中hIGF－1 mRNA的表達(dá)

3 ELISA法檢測(cè)hIGF－1表達(dá)

ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，IGF組細(xì)胞上清中有hIGF－1蛋白的表達(dá)。而GFP組細(xì)胞及control組細(xì)胞上清中未檢測(cè)到hIGF－1蛋白的表達(dá)，見圖3，hIGF－1的有效表達(dá)在成肌細(xì)胞至少可持續(xù)4周以上。

Figure 3.Expression of hIGF－1 in conditioned medium detected by ELISA..n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs GFP.圖3 ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞分泌的hIGF－1濃度

4 IGF－1基因轉(zhuǎn)染促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖

3個(gè)不同組最初培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)為2×106，基因轉(zhuǎn)染后3 d，IGF組和GFP組細(xì)胞數(shù)顯著低于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞［IGF組:(1.21±0.04)× 106，GFP組:(1.23±0.03)×106cells，control組:(2.87 ±0.13) ×106］，然而到轉(zhuǎn)染后14 d，IGF組的細(xì)胞數(shù)顯著高于GFP組的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞［IGF組:(11.36±0.01)×106，GFP 組:(8.09 ±0.02)×106，control組:(10.58±0.02)×106］，IGF 組增加的細(xì)胞數(shù)顯著高于GFP組和control組(P＜0.05)，見圖4。

Figure 4.The numbers of increased myoblasts in different groups..n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs GFP.圖4 基因轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞后增加的細(xì)胞數(shù)

5 IGF－1基因轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞對(duì)成肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的影響

成肌細(xì)胞缺血再灌注損傷6 h后細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示:缺血/再灌注損傷后IGF－1基因轉(zhuǎn)染的成肌細(xì)胞的凋亡百分率顯著低于GFP基因轉(zhuǎn)染的成肌細(xì)胞。IGF－1基因轉(zhuǎn)染顯著抑制了成肌細(xì)胞的凋亡(P＜ 0.05)，見圖5。

6 RT－PCR檢測(cè)IGF－1基因轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞對(duì)成肌細(xì)胞bax和bcl－2 mRNA表達(dá)的影響

成肌細(xì)胞缺血再灌注損傷6 h后，RT－PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，IGF組成肌細(xì)胞的bax mRNA表達(dá)顯著低于GFP組的成肌細(xì)胞，bcl－2 mRNA表達(dá)顯著高于GFP組成肌細(xì)胞(P＜0.05)，見圖6。IGF－1基因轉(zhuǎn)染顯著增加了抗凋亡基因的表達(dá)，抑制了促凋亡基因的表達(dá)。

7 Western blotting檢測(cè) IGF－1基因轉(zhuǎn)染對(duì)caspase－3表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果顯示，IGF組細(xì)胞與GFP組細(xì)胞相比，活化的caspase－3蛋白表達(dá)顯著降低(P ＜ 0.05)，見圖7。

討 論

基因修飾的細(xì)胞移植為受損心肌的修復(fù)提供了有效方法，但是，細(xì)胞移植存在的最大問題是移植細(xì)胞的生存問題。大部分被移植細(xì)胞在移植早期由于損傷心肌的缺血及炎性氧化應(yīng)激環(huán)境而發(fā)生死亡。細(xì)胞的死亡直接影響著心功能的恢復(fù)。研究證實(shí)通過聯(lián)合基因治療可以改善移植細(xì)胞的生存，從而改善心臟功能［6－8］。因此，尋找一個(gè)理想的候選細(xì)胞和一個(gè)有效的抗凋亡基因是目前細(xì)胞移植的一個(gè)關(guān)鍵問題。

Figure 5.Apoptotic cells in different groups detected by TUNEL(×200)..n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs GFP.圖5 hIGF－1基因轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞對(duì)成肌細(xì)胞缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡的影響

Figure 6.Expression of bcl－2(A)and bax(B)mRNA after ischemia/reperfusion injury detected by RT－PCR..n=6.*P＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs GFP.圖6 RT－PCR檢測(cè)各組細(xì)胞缺血再灌注損傷后bax和bcl－2的表達(dá)

Figure 7.Expression of cleaved caspase－3 after ischemia/reperfusion injury detected by Western blotting..n=6.*P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs GFP.圖7 Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞缺血再灌注損傷后活化的caspase－3蛋白的表達(dá)

近年來，人們嘗試用多種干細(xì)胞移植到受損心肌，來改善受損的心功能。目前用于試驗(yàn)研究的移植細(xì)胞有多種，最常用的細(xì)胞有胚胎心肌細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、自體骨髓干細(xì)胞、骨骼肌成肌細(xì)胞(肌衛(wèi)星細(xì)胞)、內(nèi)皮干細(xì)胞［9］。各種細(xì)胞均有自己的優(yōu)點(diǎn)和不足:胚胎心肌細(xì)胞與心肌細(xì)胞成分最相近，是最好的選擇，但存在著供體細(xì)胞缺少、移植后的排斥反應(yīng)以及倫理沖突等問題。胚胎干細(xì)胞為多能干細(xì)胞，在體外培養(yǎng)可以分化出心肌細(xì)胞，但也存在著來源受限、移植后的排異反應(yīng)，以及倫理學(xué)的問題。而自體骨髓干細(xì)胞、骨骼肌成肌細(xì)胞、內(nèi)皮干細(xì)胞移植則沒有論理學(xué)的制約，也不存在排異問題，不需要終身免疫抑制治療，因此得到了廣泛的研究［10－12］。

骨骼肌成肌細(xì)胞是骨骼肌的前體細(xì)胞，成肌細(xì)胞因其獨(dú)特的生物學(xué)特性使其成為基因治療［13］和細(xì)胞移植的理想載體［14］。來源于骨骼肌的成肌細(xì)胞具有:(1)來源豐富，取材方便(只需局部麻醉)，植入自體不引起排斥反應(yīng);(2)體外容易擴(kuò)增培養(yǎng):與造血干細(xì)胞不同，成肌細(xì)胞分離、培養(yǎng)簡(jiǎn)單，體外擴(kuò)增效率較高的;(3)易于外源基因?qū)?成肌細(xì)胞是貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，在體外容易轉(zhuǎn)入外源基因，并表達(dá)高水平目的基因產(chǎn)物，并可以分泌重組蛋白;(4)成肌細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗缺血能力，并可以在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期存活，有利于目的蛋白穩(wěn)定、持續(xù)地表達(dá);(5)成肌細(xì)胞移植后不影響鄰近組織的生理功能，而且肌肉組織易于重復(fù)活檢，應(yīng)用安全;(6)容易通過注射傳遞，為大規(guī)模細(xì)胞移植提供了條件;(7)在體內(nèi)不會(huì)無限制增殖，沒有致瘤作用?；谝陨线@些條件，基因修飾的成肌細(xì)胞注入到動(dòng)物體內(nèi)，可作為生物細(xì)胞工程治療的載體細(xì)胞，來治療某些基因丟失或缺陷疾病，如肌營(yíng)養(yǎng)不良癥，內(nèi)分泌缺陷，凝血功能障礙(如血友病)等癥。植入后容易與宿主的肌纖維融和，己成為成體干細(xì)胞的一個(gè)研究熱點(diǎn)和最具價(jià)值的組織工程細(xì)胞，具有廣泛的應(yīng)用前景［14－16］。

IGF－1是由肝臟合成和分泌的胰島素家族的一種多肽。由于其廣泛的生物學(xué)活性而被廣泛地應(yīng)用于臨床。它在細(xì)胞的分化、增殖、個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要的促進(jìn)作用。作為刺激因子，可以促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂。抑制細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等生物活性。因此，IGF－1成為基因治療某些疾病的理想靶點(diǎn)［2－3］。將hIGF－1基因?qū)牍趋兰〕杉〖?xì)胞，治療缺血性疾病(如心肌缺血損傷)以及促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)將具有更好的效果。為此，我們首先探討了hIGF－1本身對(duì)骨骼肌成肌細(xì)胞的增殖與凋亡是否有影響。

目的基因的轉(zhuǎn)染有穩(wěn)定和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染兩種。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中，目的基因序列不整合到宿主基因組中，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以整合到宿主的染色體中，因此可以實(shí)現(xiàn)目的基因在宿主體內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)［17－18］。

因此，本實(shí)驗(yàn)以大鼠成肌細(xì)胞作為候選細(xì)胞，IGF－1基因作為理想的靶基因，將攜帶hIGF－1的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的成肌細(xì)胞，并從mRNA水平、蛋白水平及細(xì)胞水平均可檢測(cè)到IGF－1基因在靶細(xì)胞內(nèi)的存在，而對(duì)照組未見hIGF－1的表達(dá)，證明IGF－1基因成功轉(zhuǎn)染到成肌細(xì)胞中并在轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平得以表達(dá)。一個(gè)基因的最終表達(dá)結(jié)果是產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白質(zhì)，因此檢測(cè)蛋白質(zhì)是測(cè)定基因表達(dá)的主要標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)利用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)hIGF－1基因轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞，并用G418篩選后，可見轉(zhuǎn)染細(xì)胞幾乎全部表達(dá)，說明轉(zhuǎn)染hIGF－1基因的成肌細(xì)胞可穩(wěn)定、高效地表達(dá)hIGF－1。

本研究用重組hIGF－1轉(zhuǎn)染骨骼肌成肌細(xì)胞，然后觀察了hIGF－1對(duì)成肌細(xì)胞增殖及缺血再灌注損傷后凋亡的影響。結(jié)果顯示，IGF－I基因轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞后，攜帶hIGF－1基因的成肌細(xì)胞可以持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)hIGF－1，在體外顯著促進(jìn)了成肌細(xì)胞的增殖，并可對(duì)抗缺血缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。由于在細(xì)胞移植治療中需要大量的細(xì)胞，這為成肌細(xì)胞在IGF－I誘導(dǎo)下的擴(kuò)增及將來臨床大規(guī)模的細(xì)胞移植提供了有利的條件。

Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，細(xì)胞凋亡的最終途徑為激活caspase－3蛋白酶，caspase－3通常以酶原的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段被激活，活化的caspase－3裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。另外，在凋亡過程中，Bcl－2和Bax也起著非常重要的作用，Bcl－2是抑制凋亡的主要蛋白，Bax是促進(jìn)凋亡的主要蛋白［19］。因此，在進(jìn)一步的研究中，我們通過檢測(cè)hIGF－1基因轉(zhuǎn)染對(duì)成肌細(xì)胞caspase－3表達(dá)的影響，對(duì)bcl－2和bax mRNA表達(dá)的影響，探討了hIGF－1抑制成肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hIGF－1轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞顯著地降低了caspase－3和bax的表達(dá)，增加了bcl－2的表達(dá)，這一結(jié)果提示我們，IGF－1介導(dǎo)的抗凋亡效果可能與降低細(xì)胞的Bax和caspase－3表達(dá)，增加Bcl－2表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，IGF－1基因修飾的成肌細(xì)胞分泌的IGF－1蛋白在體外促進(jìn)了成肌細(xì)胞的增殖，減少了缺血再灌注損傷的成肌細(xì)胞的凋亡，這些結(jié)果為進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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