張玉華，李 光，俞 進(jìn)，徐妙生，李洪利

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院病理科，北京 100050)

乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP/ABCG2/MXP)是一種近來新發(fā)現(xiàn)的多藥耐藥蛋白，屬于ATP結(jié)合盒(adenosine triphosphate－binding cassette，ABC)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族［1－2］。作為細(xì)胞膜上的藥物排出泵，可將細(xì)胞毒性藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外，BCRP的過表達(dá)可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)多種化療藥物產(chǎn)生耐藥［3－5］。而新近對(duì)BCRP基因啟動(dòng)子的研究發(fā)現(xiàn)，在BCRP啟動(dòng)子的上游5'端的區(qū)域具有正性和負(fù)性調(diào)控區(qū)域，并發(fā)現(xiàn)存在一個(gè)孕激素反應(yīng)元件(progesterone response element，PRE)［6－8］。該反應(yīng)元件與乳腺癌細(xì)胞中BCRP的表達(dá)密切相關(guān)，因此孕激素可能通過與BCRP啟動(dòng)子上游的PRE結(jié)合，調(diào)控BCRP基因的表達(dá)。近期的研究也顯示了一些能夠調(diào)節(jié)BCRP表達(dá)的藥物，其中包括雌激素的類似物和拮抗劑，但目前對(duì)孕激素調(diào)控BCRP的具體機(jī)制及作用效應(yīng)尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇孕激素和BCRP基因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過藥物誘導(dǎo)或基因轉(zhuǎn)染的方法，建立由BCRP啟動(dòng)子或巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)BCRP的4種耐藥細(xì)胞系。將孕酮(progesterone，P4)加入耐藥細(xì)胞系的培養(yǎng)液中，觀察其對(duì)不同細(xì)胞系BCRP表達(dá)的影響，并深入探討孕酮對(duì)BCRP基因的效應(yīng)和可能的分子調(diào)控機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人乳腺癌細(xì)胞株P(guān)R陽(yáng)性的T47D和PR陰性的MDA－MB－231由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，均來源于美國(guó)國(guó)立癌癥研究所(National Cancer Institute)。

1.2 主要試劑 Progesterone、RU486、G418及四甲基偶氮唑鹽［3－(4，5－dimethythiazol－2－yl)－2，5－diphenyltetrazolium bromide，MTT］均購(gòu)自Sigma;pcDNA3載體由本實(shí)驗(yàn)室保存;質(zhì)粒提取試劑盒為Qiagen產(chǎn)品;LipofectamineTM2000試劑盒購(gòu)自Invitrogen;Trizol reagent和RT－PCR kit為TaKaRa產(chǎn)品;BCRP抗體(BXP－53)購(gòu)自Abcam;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgGⅡ抗購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司;DMEM和胎牛血清為Gibco產(chǎn)品;引物由上海生工生物公司合成;米托蒽醌(mitoxantrone，MX)購(gòu)自江蘇恒瑞制藥股份有限公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)為啟光試劑公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞株孕酮受體(progesterone receptor，PR)陽(yáng)性的T47D和PR陰性的MDA－MB－231在含有10%胎牛血清及青霉素、鏈霉素各105U/L的DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)(37℃、5%CO2)。0.25%胰酶(含0.02%EDTA)混合液消化，每2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 米托蒽醌誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞系T47D/MX和MDA－MB－231/MX的建立 米托蒽醌誘導(dǎo)篩選乳腺癌細(xì)胞T47D和MDA－MB－231，在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中加入米托蒽醌，首先起始濃度為8 μg/L，細(xì)胞傳3代后，逐漸增加米托蒽醌的篩選濃度至 20 μg/L、40 μg/L、80 μg/L 和 100 μg/L［9］，最終建立由BCRP啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)BCRP的2種耐藥細(xì)胞系:PR陽(yáng)性的T47D/MX和PR陰性的MDA－MB－231/MX。

2.3 脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞建立T47D/CMV－BCRP和MDA－MB－231/CMV－BCRP耐藥細(xì)胞系 重組質(zhì)粒pcDNA3－CMV－BCRP含有CMV啟動(dòng)子和野生型BCRP基因，由美國(guó)Marryland大學(xué)的Douglas Ross教授惠贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室保存。將質(zhì)粒pcDNA3－CMV－BCRP轉(zhuǎn)染PR陽(yáng)性的T47D和PR陰性的MDA－MB－231乳腺癌細(xì)胞系，并經(jīng)350 mg/L G418篩選后，建立由CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)BCRP的2種耐藥細(xì)胞系:PR陽(yáng)性的T47D/CMVBCRP和PR陰性的MDA－MB－231/CMV－BCRP。這2種細(xì)胞作為對(duì)照。

2.4 不同藥物處理細(xì)胞 T47D/MX、T47D/CMV－BCRP、MDA－MB－231/MX和MDA－MB－231/CMV－BCRP 4種細(xì)胞株按常規(guī)方法培養(yǎng)。選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，每株調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×105接種于24孔板，每組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)分組:(1)空白組:只加細(xì)胞不加藥物;(2)孕酮單獨(dú)作用組:細(xì)胞接種 24 h后，加入不同濃度(10－7mol/L 、10－6mol/L、10－5mol/L)的孕酮繼續(xù)培養(yǎng)96 h;(3)孕酮和RU486聯(lián)合作用組:細(xì)胞接種24 h后，加入10－5mol/L孕酮，48 h后再加入10－5mol/L RU486，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。藥物和培養(yǎng)基每24 h更換1次，72 h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

2.5 RT－PCR檢測(cè)BCRP mRNA的表達(dá)水平 UNIQ－10柱式總RNA抽提試劑盒提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞的總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定260 nm和280 nm波長(zhǎng)的吸光度值(A)，計(jì)算 RNA純度(A260/A280=1.8～2.0)及 RNA 含量。根據(jù)引物分析軟件自行設(shè)計(jì):BCRP引物正義鏈5'－TGGCTGTCATGGCTTCAGTA －3'，反義鏈5'－GCCACGTGAT TCTTCCACAA－3'，擴(kuò)增片段為235 bp;內(nèi)參照GAPDH引物正義鏈5'－CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT －3'，反義鏈 5'－AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC －3'，擴(kuò)增片段為 307 bp。逆轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，其中含4 μg RNA 樣本，1 μL 隨機(jī)引物，2 μL dNTP混合物，1 μL逆轉(zhuǎn)錄酶，反應(yīng)條件為30℃ 10 min，45℃ 30 min，99℃ 5 min。隨后產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為 100 μL，其中逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5 μL，Tap 酶0.5 μL(5 ×106U/L)，BCRP上、下游引物各 10 μL，GAPDH 上、下游引物各 10 μL。95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃ 5 min，95 ℃ 50 s，52 ℃ 30 s，72℃ 1 min，循環(huán)32次，72℃5 min。取PCR產(chǎn)物20 μL進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析，BCRP指數(shù)=BCRP灰度值/GAPDH灰度值，該指數(shù)與BCRP mRNA的量成正比，進(jìn)行BCRP mRNA表達(dá)水平的半定量分析。

2.6 Western blotting檢測(cè)BCRP蛋白的表達(dá)變化 各組細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液，按常規(guī)方法提取細(xì)胞總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。取50 μg蛋白變性、電泳、轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，麗春紅染色，5%脫脂牛奶封閉，洗膜后加Ⅰ抗BCRP(1∶1000)或GAPDH(1∶5000)4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的Ⅱ抗IgG(1∶4000)孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒于暗室自顯影。實(shí)驗(yàn)以GAPDH為參照，采用BandScan 5.0軟件測(cè)量特異條帶的灰度值，以目的條帶的灰度值與對(duì)應(yīng)GAPDH灰度值之比表示BCRP蛋白的含量。

2.7 米托蒽醌外排實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BCRP的轉(zhuǎn)運(yùn)功能 米托蒽醌是BCRP特異性轉(zhuǎn)運(yùn)的熒光物質(zhì)，當(dāng)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的BCRP轉(zhuǎn)運(yùn)功能降低時(shí)，米托蒽醌在細(xì)胞內(nèi)聚集，熒光強(qiáng)度高于耐藥細(xì)胞［9］。常規(guī)胰酶、EDTA消化各組細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液并轉(zhuǎn)移至24孔板。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基DMEM或含有20 μmol/L米托蒽醌和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min。收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)米托蒽醌的熒光強(qiáng)度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。每次實(shí)驗(yàn)相同條件重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。多樣本均數(shù)之間的比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 孕酮對(duì)不同細(xì)胞組BCRP基因mRNA表達(dá)的影響

RT－PCR結(jié)果顯示，與未處理組相比，孕酮以劑量依賴方式增強(qiáng)BCRP mRNA的表達(dá)，孕酮處理組在濃度10－7、10－6和10－5mol/L時(shí)，T47D/MX細(xì)胞中BCRP mRNA的條帶明顯增強(qiáng)，表達(dá)水平上調(diào)，分別是未處理組的2.64倍(P＜0.05)、4.71倍(P ＜0.05)和 7.95倍(P ＜0.01)倍，見圖 1A;10－5mol/L孕酮和10－5mol/L RU486聯(lián)合處理組，T47D/MX細(xì)胞中BCRP mRNA的表達(dá)水平顯著低于10－5mol/L孕酮單獨(dú)處理組(處理前后相對(duì)BCRP mRNA表達(dá)率:231.8% ±2.4%vs 74.9% ±1.3%，P＜0.01)，見圖1A。這提示孕酮對(duì) BCRP mRNA表達(dá)的增強(qiáng)效應(yīng)，可被其拮抗劑RU486阻斷，兩藥之間存在拮抗作用。而對(duì)照組T47D/CMV－BCRP細(xì)胞，處理前后細(xì)胞中BCRP mRNA的表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P＞0.05)，見圖1B;且對(duì)照組MDA－MB－231/MX和MDA－MB－231/CMV－BCRP細(xì)胞，各組處理前后相比，BCRP mRNA表達(dá)量無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2 孕酮對(duì)不同細(xì)胞組BCRP蛋白表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果顯示，與未處理組相比，10－7、10－6和10－5mol/L孕酮以劑量依賴方式增強(qiáng)T47D/MX細(xì)胞中BCRP蛋白的表達(dá)，增加倍數(shù)分別為1.94(P＜0.05)、4.65(P＜0.05)和7.02(P ＜0.01)，見圖 2A;10－5mol/L 孕酮和 10－5mol/L RU486聯(lián)合處理組，T47D/MX細(xì)胞中BCRP蛋白的相對(duì)表達(dá)水平為46.2% ±1.3%，明顯低于10－5mol/L孕酮單獨(dú)處理組(相對(duì) BCRP蛋白表達(dá)率:147.9% ±3.2%，P＜0.01)，見圖2A，兩藥之間存在拮抗作用。而對(duì)照組T47D/CMV－BCRP細(xì)胞，處理前后細(xì)胞中BCRP蛋白的相對(duì)表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P＞0.05)，見圖2B;且對(duì)照組MDA－MB－231/MX和MDA－MB－231/CMV－BCRP細(xì)胞，處理方法同前，各組處理前后相比，BCRP蛋白的含量無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3 孕酮對(duì)不同細(xì)胞組BCRP轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響

米托蒽醌是BCRP的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)底物，常用于檢測(cè)BCRP的外排功能。米托蒽醌外排實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未處理組相比，10－5mol/L孕酮單獨(dú)處理組，T47D/MX細(xì)胞內(nèi)米托蒽醌熒光強(qiáng)度顯著降低，峰值左移，見圖3A，外排米托蒽醌的能力升高了41.7%(處理前后相對(duì)米托蒽醌熒光強(qiáng)度:100.0%，141.7% ±6.4%，P ＜0.05)，見圖 3A、表1;10－5mol/L 孕酮和10－5mol/L RU486聯(lián)合處理后，T47D/MX細(xì)胞內(nèi)的米托蒽醌熒光強(qiáng)度明顯高于孕酮單獨(dú)處理組，峰值右移，見圖3A，外排米托蒽醌的能力降低了20.3%(處理前后相對(duì)米托蒽醌熒光強(qiáng)度:141.7% ±6.4%vs 112.9% ±5.2%，P ＜0.05)，見圖3A、表1，兩藥之間存在拮抗作用;而對(duì)照組T47D/CMV－BCRP、MDA－MB－231/MX和MDA－MB－231/CMV－BCRP細(xì)胞，各組處理前后相比，細(xì)胞中米托蒽醌熒光強(qiáng)度無(wú)明顯改變(P＞0.05)，見圖3B、表1。

Figure 1.Effects of progesterone on BCRP mRNA expression in T47D/MX and T47D/CMV－BCRP cells..n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control(0 mol/L P4+0 mol/L RU486);##P＜0.01 vs 10－5mol/L P4+10－5 mol/L RU486.圖1 孕酮對(duì)T47D/MX和T47D/CMV－BCRP細(xì)胞BCRP mRNA表達(dá)的影響

討 論

Figure 2.Effects of progesterone on BCRP protein expression in T47D/MX and T47D/CMV－BCRP cells..n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control(0 mol/L P4+0 mol/L RU486);##P＜0.01 vs 10－5mol/L P4+10－5 mol/L RU486.圖2 孕酮對(duì)T47D/MX和T47D/CMV－BCRP細(xì)胞BCRP蛋白表達(dá)的影響

BCRP是新近發(fā)現(xiàn)的與腫瘤多藥耐藥相關(guān)的一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與P－糖蛋白(P－glycoprotein，P－gp)同屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一種能量依賴性藥物排出泵，消耗ATP將細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出，減少細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，降低藥物對(duì)腫瘤的殺傷作用。高表達(dá)BCRP的腫瘤細(xì)胞株對(duì)米托蒽醌、阿霉素、柔紅霉素等多種化療藥物可產(chǎn)生交叉耐藥［3－5］，該蛋白在多藥耐藥方面逐漸引人關(guān)注。人類的BCRP基因首次在乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF－7/AdrVp的DNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)而命名，定位于染色體4q22區(qū)域，含有1個(gè)開放閱讀框架。BCRP基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA長(zhǎng)約2.4 kb，編碼655個(gè)氨基酸殘基、72.6 kD的蛋白質(zhì)。BCRP蛋白僅含有1個(gè)跨膜區(qū)域和1個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)，在空間結(jié)構(gòu)上僅相當(dāng)于完全轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P－gp分子的一半，故稱為半轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［10］。因此，有學(xué)者認(rèn)為BCRP是耐藥蛋白的基本結(jié)構(gòu)，了解BCRP的作用機(jī)制對(duì)于研究其它耐藥蛋白大有幫助。

近來有研究報(bào)道，孕激素、雌激素的類似物或拮抗劑可以逆轉(zhuǎn)K562/BCRP細(xì)胞中BCRP介導(dǎo)的多藥耐藥，如孕酮、雌二醇、三苯氧胺［11－12］，其機(jī)制可能是作為BCRP的底物，競(jìng)爭(zhēng)性抑制BCRP與其它抗腫瘤藥物結(jié)合。2004年，Ee等［7］發(fā)現(xiàn)在BCRP基因啟動(dòng)子區(qū)的5'端側(cè)翼序列的－243至－115之間含有1個(gè)雌激素反應(yīng)元件(estrogen response element，ERE)結(jié)構(gòu)，該反應(yīng)元件與乳腺癌細(xì)胞中BCRP的表達(dá)密切相關(guān)。而最新分析認(rèn)為［8］，胎盤絨毛膜細(xì)胞癌中BCRP啟動(dòng)子區(qū)的ERE同時(shí)也是一個(gè)PRE，孕酮可能通過PR與BCRP啟動(dòng)子區(qū)的PRE相結(jié)合，增強(qiáng)BCRP的表達(dá)。關(guān)于孕激素對(duì)BCRP基因的具體作用機(jī)制及影響，以往的研究報(bào)道缺乏一致性結(jié)果。因此，孕激素及其受體在BCRP表達(dá)調(diào)控中的作用過程、影響因素及綜合效應(yīng)目前尚不十分清楚。

我們前期實(shí)驗(yàn)顯示，托瑞米芬可通過ERα介導(dǎo)抑制BCRP基因的啟動(dòng)子而減弱BCRP轉(zhuǎn)錄活性，降低ERα陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中BCRP mRNA和蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)BCRP 介導(dǎo)的多藥耐藥［13］。

本實(shí)驗(yàn)通過藥物誘導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)染的方法，作用于孕激素受體陽(yáng)性的T47D和PR陰性的MDA－MB－231乳腺癌細(xì)胞系，成功建立了分別由含PRE的BCRP啟動(dòng)子和不含PRE的CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)BCRP的4種耐藥細(xì)胞系T47D/MX、T47D/CMV－BCRP、MDA－MB－231/MX和MDA－MB－231/CMV－BCRP，觀察孕酮對(duì)不同的乳腺癌耐藥細(xì)胞系BCRP表達(dá)的影響，尚未見相關(guān)報(bào)道。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，孕酮能夠在轉(zhuǎn)錄水平明顯增強(qiáng)T47D/MX細(xì)胞中BCRP mRNA的表達(dá)，但卻不能抑制T47D/CMVBCRP、MDA－MB－231/MX和MDA－MB－231/CMVBCRP細(xì)胞中BCRP mRNA的表達(dá)水平。分析存在差異的原因:前者T47D/MX細(xì)胞中BCRP的表達(dá)是由含PRE的BCRP啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)，且細(xì)胞是PR陽(yáng)性的;而后者T47D/CMVBCRP細(xì)胞中BCRP表達(dá)是由不含PRE的CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá);且 MDA－MB－231/MX和 MDA－MB－231/CMVBCRP細(xì)胞是PR陰性的。這提示，孕酮不是作為BCRP的底物調(diào)節(jié)其功能，而可能是通過PR的介導(dǎo)與BCRP啟動(dòng)子區(qū)的PRE序列結(jié)合，激活BCRP基因啟動(dòng)子而增強(qiáng)BCRP基因mRNA的轉(zhuǎn)錄。本研究通過Western blotting測(cè)定了BCRP蛋白的表達(dá)水平，米托蒽醌外排實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了BCRP的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。結(jié)果顯示，孕酮顯著上調(diào)PR陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中BCRP蛋白的表達(dá)，明顯升高細(xì)胞外排米托蒽醌的能力。

然而，由于PR亞型PRA和PRB受體的存在，并可通過PRE與AP1位點(diǎn)2種方式介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使得PR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程更為復(fù)雜。在孕酮調(diào)控BCRP的過程中，是以某一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為主還是幾種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同發(fā)揮作用?幾種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間是否存在相互影響?尚未見報(bào)道，將成為今后深入研究的方向。

Figure 3.Effects of progesterone on the intracellular accumulation of mitoxantrone in T47D/MX and T47D/CMV －BCRP cells.圖3 孕酮對(duì)T47D/MX和T47D/CMV－BCRP細(xì)胞BCRP轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響

表1 孕酮對(duì)各組細(xì)胞BCRP外排米托蒽醌的影響Table 1.Effects of progesterone on BCRP－mediated mitoxantrone efflux activity

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