劉興漠，項(xiàng)禹誠，孫 青，潘 滔，黃 帥，王德春

(中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510655)

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是關(guān)節(jié)疾病中最常見的類型之一，其病理過程以軟骨細(xì)胞的凋亡和軟骨基質(zhì)的破壞為特征。研究證實(shí)異常的應(yīng)力刺激會造成軟骨細(xì)胞功能下降、失調(diào)，使基質(zhì)合成減少，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)退變的啟動及發(fā)展［1］。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)途徑是真核細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞外信號(包括力學(xué)信號)到細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的一類重要信號系統(tǒng)。目前研究最多的主要集中在其家族的3個成員上:細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)、c－Jun N末端激酶(JNK)以及p38 MAPK。我們前期研究已證實(shí)，在關(guān)節(jié)軟骨缺損和OA的動物模型中，軟骨細(xì)胞過度表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶類(matrix metalloproteinases MMPs)［2］。本次實(shí)驗(yàn)利用 Flexercell－4000 型力學(xué)加載系統(tǒng)對OA軟骨細(xì)胞加載強(qiáng)度不同的周期性張應(yīng)力(cyclic tensile strain，CTS)，觀察 OA軟骨細(xì)胞在 MMPs途徑上游事件中p38 MAPK及其磷酸化產(chǎn)物的活化和表達(dá)的變化，揭示軟骨在細(xì)胞分子水平上與力學(xué)環(huán)境的相互作用特點(diǎn)。

材料和方法

1 動物、試劑及儀器

6周齡新西蘭白兔5只，體重2.0～2.5 kg，雌雄不限，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。實(shí)驗(yàn)過程中動物處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)(RT－PCR)試劑盒(上海飛捷生物技術(shù)有限公司);BioFlex6孔培養(yǎng)板(Flexcell);Flexercell－4000型力學(xué)加載系統(tǒng)(Flexcell);ABI PRISM? 7500 Sequence Detection System(上海碩盟生物科技有限公司);Bio Photometer Plus核酸蛋白測定儀(艾本德中國有限公司);ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Amersham);Polytron PT 10－35組織擴(kuò)散儀(Kinematica)。

2 OA動物造模

根據(jù)文獻(xiàn)［3］，5只新西蘭白兔用10 mg/kg戊巴比妥鈉行耳緣靜脈麻醉，隨機(jī)逐層切開一側(cè)膝部皮膚至關(guān)節(jié)囊，將髕骨推向外側(cè)，暴露關(guān)節(jié)腔，直視下尖刀切斷前交叉韌帶(輔助檢查前抽屜試驗(yàn)陽性)，髕骨回位，仔細(xì)止血，逐層閉合關(guān)節(jié)囊和皮膚。術(shù)后肌內(nèi)注射5×105U青霉素，膝關(guān)節(jié)不固定，置籠內(nèi)自由活動。

3 膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)

術(shù)后10周空氣栓塞處死動物，采用酶消化法分離獲取軟骨細(xì)胞。無菌條件下分別切取所有動物雙側(cè)膝關(guān)節(jié)表面軟骨組織，一般以不滲血為度。切成約1 mm×1 mm×1 mm大小碎塊，D－Hanks液沖洗，棄上清，稱重。用0.4%鏈霉蛋白酶(12 mL/g軟骨)37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化90 min，600 r/min離心5 min。棄上清，用0.025%II型膠原酶(12 mL/g軟骨)37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化過夜，1200 r/min離心10 min。棄上清，D－Hanks液沖洗，吸取細(xì)胞懸液，經(jīng)100 μm及40 μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾于無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4 CTS加載

非手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為正常組，手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為造模成功的OA細(xì)胞，隨機(jī)分為3組:OA+低應(yīng)力組、OA+高應(yīng)力組和OA對照組。各組細(xì)胞均按照1×105/cm2分別接種于6孔BioFlex培養(yǎng)板上，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)約60～72 h，當(dāng)軟骨細(xì)胞達(dá)到75% ～80%融合時，吸去原培養(yǎng)基，更換無血清培養(yǎng)液使細(xì)胞同步化，12 h后開始加載CTS:OA+低應(yīng)力組為 sin10%、0.1 Hz、6 h/d，OA+ 高應(yīng)力組為sin10%、1.0 Hz、6 h/d，正常組與 OA 對照組不予處理，見圖1。首次加載CTS后24 h、1周和2周將各板細(xì)胞分裝于Eppendorf管，－20℃凍存以備檢測。

Figure 1.Schematic Flexercell－4000 system.Flexercell flexible hydrophilic cell culture plate surface can reach 200%of the basement membrane elongation and suction gas in the sealed cavity between the basement membrane and the base which resulting a negative pressure and substrate deformation.The gas suction rate through software could be controlled to adjust the bottom of the vertical elastic deformation and the ultimate strength of the force control cells.圖1 Flexercell－4000型力學(xué)加載系統(tǒng)示意圖

5 RT－PCR測定MMP13 mRNA及p38 MAPK表達(dá)

按試劑盒說明書操作，用Trizol試劑提取總RNA，取1 μL RNA樣品50倍稀釋，在Bio－Photometer Plus核酸蛋白測定儀上測定A值并與內(nèi)參照(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GADPH)同時擴(kuò)增。MMP－13引物序列正義鏈 5'－AGGAGCATGGCGACTTCTAC －3'，反義鏈 5'－TAAAAACAGCTCCGCATCAA－3'。p38 MAPK引物序列正義鏈5'－GATCAGTTGAAGCTCATTTTAA －3'，反義鏈 5'－CACTTGAATAATATTTGGAGAGT－3'，片段長度479 bp。GAPDH 引物序列正義鏈5'－CAAGATTGTCAGCAACGCAT－3'，反義鏈5'－ACAAAGTGGTCATTGAGGGC －3'，片段長度 231 bp。擴(kuò)增條件為:95 ℃1.5 min，55 ℃ 1 min，70 ℃ 1 min，40個循環(huán)。擴(kuò)增完畢后檢測p38 MAPK mRNA的表達(dá):8 μL產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下攝像。以目的基因與內(nèi)參照基因條帶的積分吸光度比值檢測基因的表達(dá)水平。

6 Western blotting法檢測p38 MAPK磷酸化產(chǎn)物的表達(dá)

對上述提取mRNA的樣品繼續(xù)提取總蛋白并定量，經(jīng)10%非變性SDS－PAGE，電轉(zhuǎn)移至NC膜，特異性抗體雜交反應(yīng)后ECL顯色，將顯影后所得條帶經(jīng)掃描保存為*.tiff文件后，采用Totallab 2.01圖像分析軟件對條帶灰度進(jìn)行分析和比較。

7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，分別對各組檢測結(jié)果的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大體觀察

非手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)無明顯關(guān)節(jié)積液及滑膜增生，關(guān)節(jié)軟骨面光滑，色澤明亮，而手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)術(shù)后均腫脹變形，在第10周時關(guān)節(jié)軟骨均失去原有光澤，顏色明顯變暗，肉眼觀有粗糙感，股骨內(nèi)外髁部均有圓形軟化灶，股骨雙髁及脛骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)表面軟骨有缺損，軟骨下骨外露，見圖2，關(guān)節(jié)液增多，關(guān)節(jié)囊、滑膜增生，血管翳形成明顯。以上結(jié)果顯示OA模型造模成功。

2 各組細(xì)胞MMP－13表達(dá)

加載CTS 24 h后，正常組和OA對照組之間的MMP－13的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);加載CTS 2周后OA+低應(yīng)力組和OA+高壓力組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);同時發(fā)現(xiàn)，OA+低應(yīng)力組MMP－13的表達(dá)持續(xù)下降，加載CTS 24 h與2周之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

Figure 2.Model of rabbit osteoarthritis.Articular cartilage lost the original luster which was dark and with a rough sense.Round malacia and cartilage defects could be found on femoral bicondylar and tibial articular surface.圖2 兔骨性關(guān)節(jié)炎模型

表1 不同時點(diǎn)各組MMP－13表達(dá)Table 1.Expression of MMP－13(.n=5)

表1 不同時點(diǎn)各組MMP－13表達(dá)Table 1.Expression of MMP－13(.n=5)

＊P ＜0.05 vs normal;△P ＜0.05 vs OA+high CTS;#P ＜0.05 vs 24 h OA+low CTS.

Group 24h 1 week 2 weeks Normal 0.102±0.035 0.113±0.021 0.103±0.013 OA+low CTS 0.729±0.007 0.518±0.025 0.210±0.045△#OA+high CTS 0.953±0.036 1.007±0.031 1.002±0.006 OA control 0.712±0.017* 0.627±0.021 0.793±0.045△

3 各組軟骨細(xì)胞p38 MAPK的表達(dá)

OA對照組p38 MAPK表達(dá)(1.013±0.012)與正常組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);加載CTS 1周后OA+高應(yīng)力組(1.092±0.003)和 OA+低應(yīng)力組(0.882 ±0.012)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);加載CTS 2周后，p38 MAPK在OA+低應(yīng)力組和OA對照組分別為0.672±0.011和1.077±0.012，兩組之間有顯著差異(P ＜0.01)，見圖3。

Figure 3.Expression of p38 MAPK..n=5.＊＊P＜0.01 vs normal;△P ＜0.05 vs OA+high CTS.▲▲P ＜0.01 vs OA control.圖3 各組p38 MAPK的表達(dá)

4 各組軟骨細(xì)胞p38 MAPK磷酸化產(chǎn)物的表達(dá)

p38 MAPK磷酸化產(chǎn)物在對照組和OA+高應(yīng)力組持續(xù)表達(dá)，而在3個時點(diǎn)OA+低應(yīng)力組的p38 MAPK磷酸化產(chǎn)物的表達(dá)呈下降趨勢，見圖4。

Figure 4.Expression of phospho－p38 MAPK.圖4 磷酸化p38 MAPK的表達(dá)

5 p38 MAPK及其磷酸化產(chǎn)物的比值

當(dāng)CTS載荷為1.0 Hz，3個時點(diǎn)p38 MAPK磷酸化產(chǎn)物與p38 MAPK的比例分別為1.083±0.003、1.069±0.006和1.051±0.011，而強(qiáng)度為 0.1Hz時，比例為 1.072±0.008、1.043±0.004和1.031±0.002。各時點(diǎn)兩組數(shù)據(jù)之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05)，見圖5。

Figure 5.Ratio of p38 MAPK and phospho－p38 MAPK..n=5.*P ＜0.05 vs OA+high CTS.圖5 p38 MAPK及其磷酸化產(chǎn)物的比值

討 論

在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展過程中，力學(xué)因素的作用不容忽視，一方面力學(xué)載荷使關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中的黏多糖含量減少，硫酸軟骨素喪失，纖維成分增加，而細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)各成分的失衡則進(jìn)一步影響各層軟骨細(xì)胞的活性，最終導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡與基質(zhì)崩解;另一方面，力學(xué)載荷可影響ECM和軟骨細(xì)胞的合成，而同時ECM和軟骨細(xì)胞也影響著力學(xué)載荷對細(xì)胞的代謝作用［4］。有研究發(fā)現(xiàn)在軟骨分泌的基質(zhì)分子組成的膠原網(wǎng)中，基質(zhì)分子遵循有利于軟骨力學(xué)功能的原則在膠原網(wǎng)結(jié)構(gòu)中沉積［5］，這說明當(dāng)力學(xué)信號傳導(dǎo)至軟骨細(xì)胞表面時，其力學(xué)效應(yīng)通過某種轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)入細(xì)胞核，再進(jìn)一步調(diào)節(jié)各種基因表達(dá)從而對力學(xué)信號做出反饋，即力學(xué)信號－生物學(xué)信號－基因表達(dá)－生物學(xué)效應(yīng)。

正常關(guān)節(jié)中MMPs與金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs)的表達(dá)量極低。由于各種理化因素的影響，MMPs與TIMPs之間的動態(tài)平衡被打破，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨ECM過度降解。大量研究證實(shí)，MMPs的過度表達(dá)可導(dǎo)致軟骨逐漸出現(xiàn)炎癥、潰瘍、缺損等一系列退行性變［6］。p38 MAPK作為MAPK家族的重要成員，可以調(diào)節(jié)包括MMPs與TIMPs在內(nèi)的多種轉(zhuǎn)錄因子及蛋白酶活性，調(diào)控細(xì)胞多種生理和病理過程［7］。當(dāng)軟骨細(xì)胞受到力學(xué)刺激后，細(xì)胞膜表面的力感受器整合素(integrin)通過FAK/SOS/Ras等通道，促使MAPKKK－MAPKK－MAPK的級聯(lián)磷酸化。激活的p38 MAPK結(jié)合并進(jìn)一步磷酸化作用底物，底物再與各自的特異性目標(biāo)結(jié)合，引起不同的細(xì)胞病理生理反應(yīng)［8］。MMPs已知有26種，根據(jù)其蛋白結(jié)構(gòu)和作用底物的特異性可以分為5個亞型，其中MMP－13的水解底物均為纖維類膠原，并且是MMPs級聯(lián)激活途徑中的關(guān)鍵MMPs［5］，我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，在關(guān)節(jié)軟骨缺損和OA的動物模型中，關(guān)節(jié)滑膜中的MMPs mRNA含量較正?；そM織明顯增高［2］。因此我們認(rèn)為在此過程中，MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑作為MMPs的上游事件起到了關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)在不同時點(diǎn)進(jìn)一步檢測各組MMP－13表達(dá)時發(fā)現(xiàn)，術(shù)后24 h正常組與OA對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，并且術(shù)后2周OA+低應(yīng)力組與OA+高應(yīng)力組表達(dá)也存在顯著差異(P＜0.05)，更值得一提的是，MMP－13在OA+低應(yīng)力組的表達(dá)隨著時間的推移而逐漸降低，與此同時，OA軟骨細(xì)胞p38 MAPK及其磷酸化產(chǎn)物的mRNA表達(dá)水平明顯高于正常軟骨細(xì)胞，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，這可能與OA軟骨細(xì)胞中由炎癥介質(zhì)(目前多認(rèn)為是白細(xì)胞介素)介導(dǎo)的Janus激酶(JAK)通過磷酸化激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducer and activator of transcription，STAT)有關(guān)［9］，而在此過程中 JAK 激活后通過信號交聯(lián)MAPK的級聯(lián)激活過程，上調(diào)p38 MAPK與其磷酸化產(chǎn)物的表達(dá)，最終使MMP－13的表達(dá)增加。

此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明不同強(qiáng)度的應(yīng)力載荷對OA軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)亦有差別(圖4)。在應(yīng)力的作用下，p38 MAPK逐步磷酸化，活化的激酶隨后轉(zhuǎn)移入胞核，通過活化轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控特定基因的表達(dá)，從而將力學(xué)信號刺激從細(xì)胞外傳到細(xì)胞核，并介導(dǎo)產(chǎn)生包括MMPs在內(nèi)的多種炎癥因子。本實(shí)驗(yàn)中加載CTS后磷酸化p38 MAPK與p38 MAPK的比值高應(yīng)力組與低應(yīng)力組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，表明當(dāng)應(yīng)力刺激增高時，p38 MAPK磷酸化產(chǎn)物增多，下游產(chǎn)物(MMP－13)的活化和表達(dá)隨之增多，而炎癥因子的過度表達(dá)又可以通過正反饋促進(jìn)MAPK的級聯(lián)磷酸化過程，進(jìn)一步激活p38 MAPK，或者通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控特定的基因表達(dá)，如白細(xì)胞介素介導(dǎo)的JAK磷酸化，最終導(dǎo)致基質(zhì)崩解與軟骨細(xì)胞凋亡［10］。

綜上所述，在軟骨疾病和損傷發(fā)生、發(fā)展和修復(fù)的過程中，力學(xué)刺激始終扮演著重要角色。本實(shí)驗(yàn)通過研究軟骨細(xì)胞在細(xì)胞分子水平上與力學(xué)環(huán)境的相互作用特點(diǎn)，初步闡明了力學(xué)信號－生物學(xué)信號－基因表達(dá)－生物學(xué)效應(yīng)過程中OA與應(yīng)力相互影響的“惡性循環(huán)”。本實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)在于未能對應(yīng)力強(qiáng)度做出定量的衡量，我們將在下一步研究中著重探討。

［1］Drury JL，Mooney DJ.Hydrogels for tissue engineering:scaffold design variables and applications［J］.Biomaterials，2003，24(24):4337 －4351.

［2］劉興漠，項(xiàng)禹誠，麥海民，等.關(guān)節(jié)軟骨－骨一體化修復(fù)體修復(fù)全層關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華骨科雜志.2011，31(4):365－371.

［3］Kyriakis JM，Avruch J.Mammalian mitogen－ activated protein kinase signal transduction pathways activated by stress and inflammation［J］.Physiol Rev，2001，81(2):807－869.

［4］Cuenda A，Rousseau S.p38 MAP－kinases pathway regulation，function and role in human diseases［J］.Biochim Biophys Acta，2007，1773(8):1358 －1375.

［5］Han J，Lee JD，Bibbs L，et al.A MAP kinase targeted by endotoxin and hyperosmolarity in mammalian cells［J］.Science，1994，265(5173):808 －811.

［6］Lee JC，Laydon JT，McDonnell PC，et al.A protein kinase involved in the regulation of inflammatory cytokine biosynthesis［J］.Nature，1994，372(6508):739 －746.

［7］Rouse J，Cohen P，Trigon S，et al.A novel kinase cascade triggered by stress and heat shock that stimulates MAPKAP kinase－2 and phosphorylation of the small heat shock proteins［J］.Cell，1994，78(6):1027 － 1037.

［8］Freshney NW，Rawlinson L，Guesdon F，et al.Interleukin－1 activates a novel protein kinase cascade that results in the phosphorylation of Hsp27［J］.Cell，1994，78(6):1039－1049.

［9］Wada Y，Shimada K，Sugimoto K，et al.Novel p38 mitogen－activated protein kinase inhibitor R2130823 protects cartilage by down－regulating matrix metalloproteinase－1，－13 and prostaglandin E2production in human chondrocytes［J］.Int Immunopharmacol，2009，6(2):144 －155.

［10］Link DP，Strandberg JD，Virmani R，et al.Histopathologic appearance of arterial occlusions with hydrogel and polyvinyl alcohol embolic material in domestic swine［J］.J Vasc Interv Radiol，2009，7(6):897 －905.