董文娟 李雙雙 鄒 坤 程 凡 周 媛

（三峽大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，湖北 宜昌 443002）

排風(fēng)藤（Solanumcathayanu）為茄科（Solanaleae）茄屬植物，我國(guó)特有種產(chǎn).三峽地區(qū)的巴東、長(zhǎng)陽(yáng)、秭歸、興山以及神農(nóng)架，全國(guó)大部分地區(qū)均有分布［1].排風(fēng)藤亦為長(zhǎng)江三峽庫(kù)區(qū)民間廣為使用的民間中草藥［2]，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)采自湖北恩施的排風(fēng)藤進(jìn)行了化學(xué)成分及其藥理活性的研究，發(fā)現(xiàn)其中所含的生物堿具有顯著的抗炎活性，而所含的番茄堿為含量較大的成分［3－4].本實(shí)驗(yàn)室曾報(bào)道［5]對(duì)自排風(fēng)藤正丁醇部位水不溶部分中分離得到的番茄堿，采用RP－HPLC精制，以精制的番茄堿為對(duì)照品，采用RP－HPLC高效液相色譜法測(cè)定排風(fēng)藤全草中番茄堿的含量.本文進(jìn)一步測(cè)定排風(fēng)藤莖葉果各部位中番茄堿的含量.采用甲醇超聲輔助浸提，浸提液濃縮得浸膏，以水懸浮，乙酸乙酯萃取除去弱極性組分，水相部分過(guò)濾，濾渣以甲醇溶解得到排風(fēng)藤待測(cè)樣品，利用RP－HPLC高效液相色譜法測(cè)定排風(fēng)藤莖葉果中番茄堿的含量，為更好地開(kāi)發(fā)利用傳統(tǒng)中草藥排風(fēng)藤［6]提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與儀器

1.1 材料與試藥

排風(fēng)藤：于2010年10月采自中國(guó)湖北恩施，其原植物標(biāo)本采自同一地區(qū)，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室楊進(jìn)副教授鑒定為Solanumcathayanu，原植物及藥材現(xiàn)保存于本實(shí)驗(yàn)室（編號(hào)：SC201010ES）.

對(duì)照品：番茄堿，為本實(shí)驗(yàn)室自排風(fēng)藤中分離得到，并經(jīng)波譜學(xué)解析（NMR，ESI－MS）并結(jié)合文獻(xiàn)［7]確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)為番茄堿，以HPLC面積歸一化法測(cè)定，純度＞98%.

對(duì)照品溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取番茄堿對(duì)照品適量，加甲醇配制成濃度約為1.0mg·mL－1的貯備液，臨用時(shí)以甲醇稀釋成0.10、0.15、0.25、0.40、0.50、0.60 mg·mL－1的系列對(duì)照品溶液.

1.2 儀器與設(shè)備

Prostar 210型高效液相色譜儀（美國(guó)瓦里安Varian）；N1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司）；ME215S型十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)Sartorius）；KQ－500DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）.

2 方 法

2.1 番茄堿的精制

對(duì)自排風(fēng)藤正丁醇水不溶部分分離得到的粗番茄堿采用 HPLC精制分離.色譜條件：YMC－Pack ODS－AA（250×10mm，5μm）色譜柱；柱溫30℃；流速4mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)203nm；流動(dòng)相為乙腈－水（90∶10，v·v－1）.番茄堿色譜峰保留時(shí)間42.6min.將上述制備得到的流分減壓濃縮，干燥得精制番茄堿，經(jīng)面積歸一化法測(cè)定純度為98.2%.

2.2 番茄堿含量分析

2.2.1 色譜條件

YMC－Pack ODS－AA（150×4.6mm，5μm）色譜柱；流速1mL·min－1；柱溫：30℃；流動(dòng)相：乙腈－水（90∶10，v·v－1）；檢測(cè)波長(zhǎng)：203nm；在此色譜條件下，對(duì)照品與供試品的保留時(shí)間一致（42.6min），供試品中番茄堿成分達(dá)到有效分離，分離度大于1.5.對(duì)照品及供試品的色譜圖如圖1所示.

圖1 番茄堿對(duì)照品和排風(fēng)藤不同部位樣品的高效液相色譜圖

2.2.2 樣品預(yù)處理

分別精密稱(chēng)取干燥的排風(fēng)藤莖、葉、果粉末2g，加入25mL甲醇室溫冷浸4h，于60℃下超聲浸提60 min，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至干，加入20mL水懸浮，用20mL乙酸乙酯萃取，分取水層，過(guò)濾，濾渣用10 mL甲醇溶解，定容.以0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，得供試品溶液，低溫保藏備用.

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

分別精密吸取各番茄堿對(duì)照品溶液20μL進(jìn)樣，按2.2.1中色譜條件測(cè)定色譜峰面積（番茄堿對(duì)照品的HPLC圖譜見(jiàn)圖a），以峰面積Y為縱坐標(biāo)，濃度X（mg·mL－1）為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線，并進(jìn)行線性回歸.結(jié)果表明，在對(duì)照品濃度為0.10～0.60mg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程：Y＝5.014 5×107X－0.248 6，r＝0.999 7.

3.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取0.10、0.25、0.60mg·mL－1的對(duì)照品溶液各20μL，按2.2.1中色譜條件連續(xù)進(jìn)樣，每個(gè)濃度進(jìn)樣3次，測(cè)定色譜峰面積，計(jì)算RSD為2.60%（n＝9），表明儀器精密度良好.

3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取排風(fēng)藤莖葉果各部位粉末約2.0g，每個(gè)部位6份，精密稱(chēng)定.按2.1方法平行制備，按2.2.1色譜條件下進(jìn)行分析，測(cè)定莖部位的平均峰面積為7 234 412，RSD為2.60%；葉部位的平均峰面積為3 237 136，RSD為2.40%；果部位的平均峰面積為6 749 496，RSD為2.80%.

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取排風(fēng)藤莖部位供試品溶液20μL，于0、4、12、24、36、48h分別進(jìn)樣，測(cè)定其平均峰面積為7 084 945，其RSD值為1.67%（n＝6），表明48h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好.

3.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知番茄堿含量的樣品9份（排風(fēng)藤莖部位樣品），平均分為3組.各樣品分別精密加入已知濃度的對(duì)照品溶液適量，按供試品溶液制備方法平行制備.按2.2.1中色譜條件，分別進(jìn)樣20μL進(jìn)行測(cè)定，得平均回收率為97.6%（n＝9），RSD為2.93%.結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 番茄堿加標(biāo)回收率的測(cè)定（n＝9）

3.6 排風(fēng)藤莖葉果中番茄堿的含量測(cè)定

按2.2.1中色譜條件測(cè)定排風(fēng)藤莖葉果中番茄堿的含量.排風(fēng)藤莖葉果部位供試液的HPLC色譜圖見(jiàn)圖1.測(cè)得排風(fēng)藤莖部位中番茄堿的含量為1.104mg·g－1，RSD為2.60%；排風(fēng)藤葉部位中番茄堿的含量為0.494mg·g－1，RSD為2.40%；排風(fēng)藤果部位中番茄堿的含量為1.030mg·g－1，RSD為2.80%；以莖部位中番茄堿含量最高.

4 結(jié) 論

本文對(duì)采用系統(tǒng)分離方法得到的排風(fēng)藤正丁醇部位中水不溶部分經(jīng)正相硅膠柱層析后，重結(jié)晶純化得到的粗番茄堿進(jìn)行HPLC精制，采用超聲輔助浸提的方法制備排風(fēng)藤供試品，并且以精制得到的番茄堿為對(duì)照品，建立了RP－HPLC法測(cè)定排風(fēng)藤莖葉果中番茄堿的含量.測(cè)得排風(fēng)藤莖葉果中番茄堿的含量分別為1.104mg·g－1、0.494mg·g－1、1.030mg·g－1，RSD分別為2.60%、2.40%、2.80%.同時(shí)還進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明方法的精密度、穩(wěn)定性、回收率等指標(biāo)均滿足測(cè)定要求，可為排風(fēng)藤藥材的質(zhì)量控制提供參考，為開(kāi)發(fā)利用三峽庫(kù)區(qū)民間中草藥排風(fēng)藤提供研究基礎(chǔ).

［1]中國(guó)科學(xué)院武漢植物研究所.湖北植物志［M].武漢：湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2002：517.

［2]余甘霖，沈 力，易東陽(yáng)，等.長(zhǎng)江三峽庫(kù)區(qū)中草藥資源調(diào)查研究［J].實(shí)用中醫(yī)藥雜志，2005，21（3）：187.

［3]謝明霞.排風(fēng)藤化學(xué)成分及抗炎、保肝藥理活性研究［D].宜昌：三峽大學(xué)，2009.

［4]張紅艷，周 媛，鄒 坤，等.排風(fēng)藤的生藥學(xué)鑒定［J].實(shí)用中醫(yī)藥雜志，2005，21（3）：187.

［5]郭江紅，周 媛，劉 蓉，等.RP－HPLC測(cè)定排風(fēng)藤中番茄堿的含量［J].中國(guó)中藥雜志，2010，35（7）：882－884.

［6]湖北省食品藥品監(jiān)督管理局.湖北省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［M].武漢：湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2009：117－118.

［7]Thorne H V，Clarke G F.The Inactivation of Herpes Simplex Virus by Some Solanaceae Glycoalkaloids［J].Antiviral Res，1985，5（6）：335－343.