Nguyen Van-luc 徐 斐 于勁松 華澤釗

(上海理工大學(xué)低溫與食品冷凍研究所 上海 200093)

作為廣譜高效的有機磷殺蟲劑，甲胺磷(Methamidophos，MTD)曾廣泛用于世界各地。由于其對哺乳動物的高毒性以及其長期殘留性，近年來國家對于甲胺磷的使用有嚴格的限制，甚至禁止使用于蔬菜及水果種植中。但是由于違禁使用甲胺磷而導(dǎo)致的安全事件仍時有發(fā)生，因此很有必要建立適用于現(xiàn)場檢測的快速、便捷的檢測方法[1]。

目前，農(nóng)藥殘留快速檢測主要基于酶抑制或免疫分析原理，結(jié)合光度法，以吸光度值作為指標，通過測定固定于載體上的殘余酶活性或標記在抗體上的酶活性來間接衡量農(nóng)藥的殘留量[2]。然而，這類光學(xué)檢測易受電化學(xué)物質(zhì)和光學(xué)物質(zhì)(如樣品顏色)的干擾，造成檢測結(jié)果的誤差[3]。量熱方法可以克服光學(xué)方法的不足，且有通用性強的優(yōu)點。但是，酶抑制法中酶與底物的反應(yīng)放熱量很小，測量困難；而免疫分析法中的氧化還原酶類的放熱量雖然較大，但是制備單克隆抗體的成本較高[4]。因此，參考以上兩種方法，基于酯酶-農(nóng)藥抑制劑之間的結(jié)合和免疫學(xué)中的抗體-抗原結(jié)合都是特異性結(jié)合這一原理，將酯酶看作抗體，將農(nóng)藥看作抗原，利用葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase，GOx)等氧化還原酶來標記農(nóng)藥，制得酶標農(nóng)藥，并使酶標農(nóng)藥與待測農(nóng)藥競爭性地與酯酶發(fā)生抑制結(jié)合反應(yīng)(見圖1所示)，通過檢測氧化還原酶類反應(yīng)體系獲得較大的反應(yīng)熱，從而采用量熱方法來快速檢測農(nóng)藥殘留。

具有一定活力穩(wěn)定性的酶標農(nóng)藥是下一步進行農(nóng)藥殘留檢測的必要基礎(chǔ)，但眾多研究表明，具有生物活性的酶，其活性在貯存過程中降低是不可避免的。這種活性降低速率與包括溫度在內(nèi)的外界條件控制有關(guān)，而運用適當?shù)谋Ｗo劑和低溫條件可以有效地延長不同生物活性材料的活性保存期[5-12]。采用加速實驗中獲得的較優(yōu)保護劑配方對酶標甲胺磷的低溫貯存進行了研究，考察了60℃、30℃、4℃和-18℃下保護劑對酶標農(nóng)藥酶活力的保護效果，并通過化學(xué)動力學(xué)(Arrhenius方程)的方法對酶標農(nóng)藥在-18℃的貯存期進行預(yù)測，并進行-18℃貯存條件下的實際貯存實驗。

圖1 量熱式農(nóng)藥殘留生物傳感器的檢測原理Fig.1 Detection principle of thermal pesticide residue biosensor

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲胺磷 (Methamidophos，MTD) 99.0%，分析純，購買于上海市農(nóng)藥研究所；2, 4, 6-三硝基苯磺酸 (TNBSA)、丁二酸酐(99%)、葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4, GOx)、辣根過氧化物酶 (HRP)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC)、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，分析純，購買于Sigma-Aldric公司；NaCl、K2SO4、CaCl2(AR)，購買于上海國藥試劑有限公司; 甘油、木糖醇、半乳糖(純度≥99%)：購買于上?？笊锛夹g(shù)有限公司。

UV1700紫外分光光度計，日本島津公司；SHZ-88臺式水浴恒溫振蕩器，江蘇太倉市實驗設(shè)備廠；S22-2定時恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器廠；SH-DpH計，上海華光儀器儀表廠；AB204-N分析天平，梅特勒-托利多; THD-4006低溫恒溫循環(huán)器(-40℃～100℃)，寧波天恒儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 酶標甲胺磷農(nóng)藥的制備

酶標物用TNBSA比色法測定酶標偶聯(lián)結(jié)合比[14-15]，使用的酶標物的甲胺磷與葡萄糖氧化酶偶聯(lián)摩爾比測得為5:1。

1.2.2 酶標活力測定方法及酶標活力保留率的計算

采用分光光度法測定酶標農(nóng)藥上的GOx活力[16]。

在酶活力測定時，先分別加入0.21mM的3,3-二甲氧基聯(lián)苯胺鹽2.4mL，10%的(w/v)D-葡萄糖0.5mL，辣根過氧化物酶溶液(6U/mL) 0.1mL，最后加0.1mL酶標農(nóng)藥，空白用0.1mL蒸餾水代替酶標農(nóng)藥。將上述試劑混勻后，置于35℃水浴中, 在波長500nm處測定吸光度值，每隔30s記錄一次吸光度(Abs), 共記錄5min。酶標農(nóng)藥中酶活力按公式(2)計算：

以時間為橫坐標，吸光度A為縱坐標作圖，其中：ΔAbs為斜率，3.1為反應(yīng)總體積；df為稀釋倍數(shù)；7.5為衰減系數(shù)；0.1為酶添加量，U為酶活力單位：在特定條件下，1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1微摩爾底物，或者底物中1微摩爾有關(guān)基團所需的酶量，稱為一個國際單位(IU，又稱U)。

將配好保護劑的溶液溶解酶標液到一定的濃度，置于60℃下保溫1h，立即取出冷卻到4℃，測定保溫前后的酶標酶活力。按下式計算，以未添加保護劑的酶標活力保留率為對照。

(3) 當同步的上一層時鐘設(shè)備是雙套的情況下，如果相互之間偏差超過50 ms，那么必須停止其中一臺時鐘設(shè)備提供時鐘源，以免影響下一層設(shè)備時鐘同步。

1.2.3 酶標農(nóng)藥的加速貯存實驗

通過高溫加速實驗，首先篩選出較優(yōu)的保護劑，然后進行正交實驗，篩選出最佳的復(fù)合保護劑配方；獲得最佳的復(fù)合保護劑配方之后，向酶標農(nóng)藥中加入最佳的復(fù)合保護劑，以未加最佳的復(fù)合保護劑的酶標農(nóng)藥作對照，分別在不同溫度(60℃、30℃和4℃)條件下進行加速貯存實驗。隔一段時間進行一次酶標活力測定，從而得到酶標農(nóng)藥在加速實驗條件下的酶活力變化曲線，之后采用化學(xué)動力學(xué)(Arrhenius方程)的方法對酶標農(nóng)藥在低溫條件下的貯存情況進行理論估計。

1.2.4 酶標農(nóng)藥的低溫貯存實驗

為了驗證加速實驗對低溫條件下的理論計算結(jié)果，進行酶標在-18℃貯存條件下加保護劑和未加保護劑時的實際貯存實驗。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用Minitab v.16 軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 保護劑篩選的加速實驗

用pH=7.4的PBS溶液配制一定濃度的氯化鈉、硫酸鉀、氯化鈣、木糖醇、半乳糖醇、甘油保護劑，按上述方法分別測定保存后酶標的酶活保留率，結(jié)果如表1。

表1 不同保護劑對酶標農(nóng)藥酶活穩(wěn)定性的影響Tab.1 Effect of different protective agents on the stability of enzyme activity of pesticides

從表1中可見，氯化鈉、硫酸鉀、氯化鈣三者相比，只有氯化鈣對酶標的穩(wěn)定性提高沒有明顯作用，而氯化鈉、硫酸鉀對酶標的酶活穩(wěn)定性保留都有較好的效果，酶標酶活力保留率分別為91.08%和82.65%。氯化鈉對酶標穩(wěn)定性的提高主要依賴于電荷中和，硫酸鉀對酶標穩(wěn)定性的提高主要加強疏水相互作用與使全酶二聚體結(jié)構(gòu)更緊湊[7]。三種多元醇， 除了半乳糖醇以外，木糖醇與甘油對酶標的酶活穩(wěn)定性保留較好的效果。酶標農(nóng)藥中加入4.0mol/L的木糖醇，60℃下1h處理后的酶活保留率為83.69%，比未加保護劑的高出22.59%。在1.0mol/L甘油的濃度中，60℃條件下保存1h后的酶活保留率為86.04%，比未加保護劑的高出24.94%。由表1可見，氯化鈉、木糖醇、甘油對酶標農(nóng)藥酶活保存的效果最佳。根據(jù)以上單因素實驗結(jié)果可知，氯化鈉、木糖醇、甘油是較好的保護劑，在此基礎(chǔ)上通過正交實驗來優(yōu)化復(fù)合保護劑濃度，以發(fā)揮各保護劑之間的協(xié)同作用，進一步提高酶標的穩(wěn)定性。實驗選用L9(33)，選取的因素、水平和結(jié)果見表2。

表2 復(fù)合保護劑的正交實驗設(shè)計及實驗結(jié)果Tab.2 Orthogonal experimental design and results of composite protective agents

通過Minitab v.16 對結(jié)果進行方差分析表明，氯化鈉對酶標穩(wěn)定性的影響最大，其次為甘油，木糖醇對酶標酶活保留率的影響較小，復(fù)合保護劑的最佳配方為A2B2C3：用2.0mol/L氯化鈉、4.0mol/L木糖醇、1.25mol/L甘油組成的復(fù)合保護劑經(jīng)60℃保存1h后酶標酶活保留率達96.30%，比未加保護劑的高出35.20%。

2.2 酶標農(nóng)藥低溫貯存期的理論預(yù)測

基于最佳的復(fù)合保護劑配方，首先考察了酶標農(nóng)藥(加保護劑和未加保護劑)在不同溫度條件下(60℃、30℃和4℃)酶活力隨溫度的變化情況，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶標農(nóng)藥在不同溫度貯存時酶活力的變化Fig.2 Enzyme activity changes of enzyme-labeled pesticides at different temperatures

酶標農(nóng)藥的酶活穩(wěn)定性，除了自身的特點以外，主要與保存狀態(tài)有關(guān)。酶的活性降低可認為是一種特殊形式的蛋白質(zhì)變性反應(yīng)。該變性作用常遵循一級反應(yīng)動力學(xué)過程，所以酶活性與貯存時間關(guān)系可用以下關(guān)系式描述[17]：

式中，Er為殘留酶活性，Eo為初始酶活性，t為貯存時間(h)，k為該溫度下酶活降低的速率常數(shù)。可見，殘留酶活變化的快慢由k決定。相同時間內(nèi)，酶活殘存率的對數(shù)與k呈負線性關(guān)系。k本身是一個受多種因素影響的常數(shù)。其他條件不變情況下，k值與貯存溫度T應(yīng)符合Arrhenius關(guān)系，即：

式中，R是通用氣體常數(shù)，E是活化能(Activation energy)，A則稱為Arrhenius因子，對于給定的反應(yīng)，A是個常數(shù)。從貯存角度說，貯存介質(zhì)條件是影響E和A的主要因素。許多酶反應(yīng)速率、心搏速率、呼吸速率、變質(zhì)反應(yīng)速率等都符合Arrhenius關(guān)系[18]。

根據(jù)一般推薦的活化能E的數(shù)值，可以算出反應(yīng)速率k隨溫度降低而衰減的情況。按此也可以得到生物活性殘留受溫度影響的關(guān)系。比如，若一生物體在4℃環(huán)境下能存活2h，那么按理論，它在-40℃能存活數(shù)日，在-80℃可以存活數(shù)月，而在-196℃(液氮溫度)可望保存幾個世紀[19]。

依據(jù)化學(xué)動力學(xué)的原理，基于圖2中各個曲線的相關(guān)方程，得到各個溫度條件下的酶活損失速率(表3)。從表3可見，溫度較高時，酶標農(nóng)藥的酶活損失速率是比較快的，隨著溫度的降低，其酶活的損失速率迅速降低。低溫貯存是有效保持酶標農(nóng)藥中的酶活力的重要手段。

表3 各溫度下的酶活損失速率Tab.3 Enzyme activity loss rate at differernt temperature

根據(jù)Arrhenius方程，lnk和1/T應(yīng)呈簡單的直線關(guān)系。按表3作圖得到圖3，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)：lnk和1/T之間的線性關(guān)系較好，且加或未加保護劑兩條曲線的斜率較一致，說明加或未加保護劑對酶活損失的溫度敏感性沒有明顯的影響。Arrhenius方程是進行單因子加速實驗時最常用的動力學(xué)模型[20]。一般加速實驗要選擇在盡量高的溫度下實施，以便在短時間內(nèi)外推得到低溫下的速率數(shù)據(jù)。外推結(jié)果的準確性與Arrhenius方程的適用溫度范圍密切相關(guān)。如果在加速高溫與外推低溫之間，食品發(fā)生相變、玻璃化轉(zhuǎn)變等，其品質(zhì)衰敗的機理可能改變，高溫實驗得到的動力學(xué)參數(shù)在低溫下不再適用，則外推結(jié)果的潛在誤差很大。因此，在進行加速實驗研究時，合理選擇加速溫度就非常重要。研究的貯藏溫度范圍較寬，跨越相變點，利用Arrhenius方程進行外推時，應(yīng)該非常慎重，應(yīng)借助實際貯存實驗對外推的理論計算準確性進行驗證。根據(jù)圖3，在進行低溫貯存實驗之前，對酶標農(nóng)藥在低溫條件下的貯存情況進行了外推的理論計算。根據(jù)Arrenius方程(圖3)， 理論計算得到：-18℃時酶活的損失速率常數(shù)k分別為4.99E-05(未加保護劑)和4.34E-06(加保護劑)；貯存2周后，酶標農(nóng)藥酶活保留率分別為98.34%(未加保護劑)和99.85%(加保護劑)；6個月后，酶活保留率分別為80.59%(未加保護劑)和98.14%(加保護劑)；12個月后，酶標保留率為64.95%(未加保護劑)和96.31%(加保護劑)。

圖3 Arrenius方程圖Fig.3 Arrenius equation graph

2.3 酶標農(nóng)藥低溫貯存的實驗驗證

為了驗證上面的理論計算結(jié)果，進行了酶標在-18℃貯存條件下的實際貯存實驗，其酶活力的變化如表4所示。根據(jù)-18℃條件下酶標的酶活力變化情況，得到其酶活損失速率常數(shù)k為：6.00E-05(未加保護劑)和6.00E-06(加保護劑)，酶活損失速率常數(shù)是理論計算的1.2024倍(未加保護劑)和1.3824(加保護劑)倍(表5)。與外推的理論計算相比，在-18℃貯存條件下實際保存2周后酶活的保留率為97.98%(未加保護劑)，99.79%(加保護劑)；貯存6個月后，酶標農(nóng)藥酶活保留率為77.13%(未加保護劑)，97.44%(加保護劑)。實際測試時酶活的保留率與理論計算相比，貯存2周后未加保護劑時其相對標準偏差為2.59%，加保護劑時0.04%；貯存6個月后未加保護劑時其相對標準偏差為3.10%，加保護劑時0.51%。這一結(jié)果將為下一步的農(nóng)殘檢測酶熱傳感器的開發(fā)提供必要的基礎(chǔ)。

表4 酶標農(nóng)藥在-18℃貯存時的酶活力變化Tab.4 Enzyme activity changes of enzyme-labeled pesticides at -18℃

表5 實際驗證與理論計算的k值對比Tab.5 k-value contrast between the actual veri fi cation and the theoretical

3 結(jié)論

為了提高葡萄糖氧化酶酶標甲胺磷農(nóng)藥的穩(wěn)定性，采用加速實驗獲得了較優(yōu)保護劑配方(2.0 mol/L氯化鈉、4.0mol/L木糖醇、1.25mol/L甘油)，對酶熱傳感器中酶標甲胺磷農(nóng)藥低溫貯存過程中的酶活變化進行了研究，結(jié)論如下：酶標農(nóng)藥低溫貯存期的理論預(yù)測顯示：酶標農(nóng)藥的貯存溫度與其酶活損失速率常數(shù)之間符合Arrhenius關(guān)系，利用Arrhenius方程可以預(yù)測酶標農(nóng)藥在低溫條件下貯存時的貯存期；實際測試時，酶活損失速率常數(shù)是理論計算的1.2024倍(未加保護劑)和1.3824倍(加保護劑)；低溫驗證試驗發(fā)現(xiàn)在-18℃貯存條件下實際保存2周后酶活的保留率為97.98%(未加保護劑)，99.79%(加保護劑)；貯存6個月后，酶標農(nóng)藥酶活保留率為77.13%(未加保護劑)，97.44%(加保護劑)。與理論預(yù)測相比，在-18℃貯存條件下實際貯存2周后二者酶活保留率的相對標準偏差為2.59%(未加保護劑)和0.04%(加保護劑)；貯存6個月為3.10%(未加保護劑)和0.51%(加保護劑)。這一結(jié)論將為酶標甲胺磷農(nóng)藥在農(nóng)藥殘留檢測生物傳感器開發(fā)中的應(yīng)用打下必要的基礎(chǔ)。

本文受上海市科委重點項目(10391901500)和上海市科技興農(nóng)重點攻關(guān)項目(2006第7- 4號)資助。(The project was supported by the Shanghai Science and Technology Commi ssion(No.10391901500)and Shanghai Agriculture Commission(2006 No.7-4).)

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