葛志華 李俊玫 李隆慶 周曉慧 (承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000)

本文采用D-半乳糖誘發(fā)衰老大鼠模型，用原位雜交法檢測下頜下腺NGF mRNA、EGF mRNA表達的改變，從基因轉(zhuǎn)錄水平探討衰老對下頜下腺分泌功能的影響及何首烏飲抗下頜下腺衰老的作用機制，為下頜下腺衰老相關疾病的防治奠定理論基礎和提供實驗數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料與儀器 VT1000S振蕩切片機(德國LEICA公司);Olympus光學顯微鏡(日本);實驗大鼠購自河北省實驗動物中心，合格證編號:605106。何首烏飲方劑由炙何首烏、懷牛膝、肉蓯蓉、淫羊藿、丹參、茯苓組成(本院賈春華教授提供)購自承德富爾康藥業(yè)有限公司。

1.2 實驗動物的選擇及分組 選用8周齡清潔級SD雌性大鼠90只，體重180～220 g，隨機分為預防性和治療性兩大實驗部分，每部分5組，每組9只。

1.3 模型的建立及各組動物的處理方法 預防性實驗部分:何首烏飲(HSWY)預防高(Ph)、中(Pm)、低 (Pl)劑量組大鼠腹腔注射D-半乳糖的同時每日分別灌胃HSWY(3.872，1.936，0.968 g/100 g，水煎濃縮成 0.6 ml/100 g)，每天一次，連續(xù)60 d。正常組(N)大鼠正常喂60 d。模型組(M)大鼠每日腹腔注射D-半乳糖(300 mg/kg)，連續(xù)60 d。治療性實驗部分;何首烏飲治療高(Th)、中(Tm)、低(Tl)劑量組大鼠腹腔注射D-半乳糖，1次/d，連續(xù) 60 d后分別灌胃 HSWY(劑量同上)，1次/d，連續(xù)60 d。陰性對照組(NC)大鼠每日按0.5 ml/100 g腹腔注射生理鹽水，連續(xù)60 d后每日灌胃生理鹽水0.6 ml/100 g，連續(xù)60 d。自然恢復組(S-R)大鼠腹腔注射D-半乳糖，1次/d，連續(xù)60 d后正常喂養(yǎng)60 d。

1.4 原位雜交標本的取材及固定 大鼠經(jīng)10%水合氯醛(0.3 ml/100 mg)腹腔注射麻醉后，開胸，經(jīng)左心室插管入主動脈，生理鹽水沖凈血液后4%多聚甲醛灌注、固定，取雙側(cè)下頜下腺，4%多聚甲醛后固定過夜。

1.5 原位雜交染色程序 常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6～8 μm。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水。30%H2O21份加蒸餾水10份混合，室溫5～10 min滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。暴露mRNA核酸片段，后固定，胃蛋白酶消化后室溫固定10 min。蒸餾水洗滌3次。預雜交，雜交，雜交后洗滌，滴加封閉液，滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃ 60 min。原位雜交 PBS洗5 min×4次。滴加SABC，37℃ 20 min。用 PBS洗5 min×3次。滴加生物素化過氧化物酶，37℃20 min。用PBS洗5 min×4次。DAB顯色，充分水洗，酒精脫水，二甲苯透明，封片。

1.6 細胞計數(shù) 對NGF mRNA、EGF mRNA原位雜交染色的切片，在400倍顯微鏡下計數(shù)陽性細胞。每只動物取3張切片，每一切片隨機檢查3個視野，計算導管細胞中陽性細胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.0軟件。計量資料用±s表示，組間比較行單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 下頜下腺NGF mRNA、EGF mRNA原位雜交結(jié)果 反應產(chǎn)物呈淺棕色或深褐色顆粒，雜交信號主要分布于紋狀管和顆粒曲管上皮細胞中，其上皮細胞胞質(zhì)呈陽性，腺泡未見陽性反應，同一導管內(nèi)不同細胞的反應程度各不相同。見圖1。

2.2 預防性實驗部分組間NGF mRNA、EGF mRNA表達比較方差分析結(jié)果顯示，組間NGF mRNA、EGF mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。多重比較結(jié)果顯示，NGF mRNA、EGF mRNA表達以N組最高，M組最低，各預防組處于中間水平，其中Pm組最高。見表1。

2.3 治療性實驗部分組間NGF mRNA、EGF mRNA表達比較

方差分析結(jié)果顯示，各組間NGF m、EGF mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。多重比較結(jié)果顯示，NGF mRNA、EGF mRNA表達以NC組最高，S-R組最低，各治療組處于中間水平，其中Tm最高。見表2。

表1 預防性實驗部分大鼠下頜下腺NGF mRNA、EGF mRNA的表達( ± s，n=9)

表1 預防性實驗部分大鼠下頜下腺NGF mRNA、EGF mRNA的表達( ± s，n=9)

與M(S-R)組比較:1)P﹤0.05，2)P﹤0.01;下表同

組別 預防組EGF mRNA 預防組NGF mRNA N組 83.44±5.102) 92.22±6.002)M組 32.78±2.82 40.78±7.14 Ph組 70.11±6.552) 73.22±5.382)Pm組 76.00±5.242) 88.33±7.731)Pl組 70.89±6.032) 73.22±6.142)

表2 治療性實驗部分大鼠下頜下腺NGF mRNA、EGF mRNA的表達( ± s，n=9)

表2 治療性實驗部分大鼠下頜下腺NGF mRNA、EGF mRNA的表達( ± s，n=9)

NGF mRNA NC組 82.56±4.592) 86.89±7.222)組別 治療組EGF mRNA 治療組S-R組 26.44±3.09 36.44±3.01 Th組 50.11±2.852) 52.44±6.542)Tm組 62.56±6.802) 64.89±4.142)Tl組 46.56±2.742) 48.11±6.752)

圖1 各組NGF mRNA、EGF mRNA表達(SP，×400)

3 討論

何首烏飲可從形態(tài)學方面延緩衰老大鼠下頜下腺的衰老改變〔1～3〕，但對其分泌功能是否有影響尚不得而知。近年來，隨著原位雜交技術的應用，人們從下頜下腺細胞中發(fā)現(xiàn)有NGF mRNA、EGF mRNA等多種生物活性物質(zhì)的mRNA表達，從基因轉(zhuǎn)錄和特異的翻譯后加工等環(huán)節(jié)證明了下頜下腺確實能自身合成這些生物活性物質(zhì)。培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細胞、雞背神經(jīng)節(jié)中的非神經(jīng)細胞、小鼠腦不同部位的膠質(zhì)細胞等組織細胞中有少量NGF存在，而在活體組織勻漿中無NGF蛋白表達，提示這些部位雖有NGF基因存在，但是處于關閉狀態(tài)，不能翻譯表達NGF。

NGF和EGF在神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育及功能維持，促進損傷神經(jīng)的再生與修復，促進上皮細胞增殖調(diào)控及細胞衰老方面具有重要作用，其表達的改變可反映下頜下腺的分泌功能狀態(tài)。NGF、EGF的生物合成在轉(zhuǎn)錄或翻譯過程中受到多種因素的調(diào)節(jié)。于輝等〔4〕的研究表明外源性的卵泡刺激素對體外孵育的大鼠下頜下腺的EGF及NGF的分泌產(chǎn)生雙向調(diào)節(jié)作用。有研究報道，外源性的雌二醇、孕酮對大鼠下頜下腺分泌EGF也有一定的作用〔5〕;糖尿病可導致下頜下腺分泌生物活性物質(zhì)GCT細胞和紋狀管的功能下降，EGF和NGF的分泌均減少〔6〕，因此，本文采用原位雜交方法，進一步探討衰老對大鼠下頜下腺組織中NGF mRNA、EGF mRNA的影響。結(jié)果表明，NGF mRNA、EGF mRNA原位雜交反應產(chǎn)物分布于紋狀管和顆粒曲管的上皮細胞，隨著下頜下腺組織的衰老改變，大鼠下頜下腺NGF、EGF基因的表達也發(fā)生改變，NGF mRNA、EGF mRNA雜交信號明顯減弱，說明衰老可從基因轉(zhuǎn)錄水平降低NGF、EGF的合成。

本研究何首烏飲由劉河間《宣明論方》何首烏丸加味而成，是通過補腎(炙何首烏、懷牛膝、肉蓯蓉、淫羊藿)，補脾(茯苓)，活血化瘀(丹參)藥物而達到補肝腎、兼健脾活血化瘀、延年益壽之功效。本研究中何首烏飲各組NGF mRNA、EGF mRNA雜交信號明顯增強，且以預防用藥效果最好，說明其能增加NGF mRNA、EGF mRNA的轉(zhuǎn)錄，對NGF、EGF基因表達的增強可能發(fā)生于轉(zhuǎn)錄水平。

1 葛志華，趙淑敏，楊桂梅，等.何首烏飲對D-半乳糖所致衰老大鼠下頜下腺超微結(jié)構(gòu)的影響〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(14):1778-80.

2 葛志華，李俊玫，王春艷.何首烏飲對衰老模型大鼠下頜下腺組織結(jié)構(gòu)的影響〔J〕.河北醫(yī)藥，2009;31(19):2532-4.

3 葛志華，高福祿，董福生.何首烏飲對D-半乳糖所致衰老大鼠下頜下腺Bcl-2、Bax表達的影響〔J〕.現(xiàn)代口腔醫(yī)學雜志，2009;23(5):512-4.

4 于 輝，劉桂云，陳 蕾，等.卵泡刺激素對體外孵育大鼠下頜下腺分泌NGF和EGF的影響〔J〕.解剖學報，2008;39(6):927-30.

5 劉曉寧，朱曉東，趙 杰，等.胃腔內(nèi)促性腺激素釋放激素類似物對大鼠消化道胃泌素細胞功能的影響〔J〕.解剖學報，2004;35(2):190-3.

6 杜金凱，王春艷，葛志華.db/db糖尿病小鼠頜下腺內(nèi)皮細胞生長因子和神經(jīng)生長因子表達的研究〔J〕.中國老年學雜志，2008;28(14):1390-1.