劉曉聰，朱慧芬，楊道鋒，曹旭東，鄧科蘭，黃春梅，胡曉萌，陳琰琰，姜素華，沈關(guān)心

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化教研室，石河子832002;2華中科技大學(xué)同濟醫(yī)院;3石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室;4華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院)

據(jù)報道，目前，我國主要的慢性肝病是乙型肝炎病毒感染所致的慢性病毒性肝炎后肝硬化［1］，可最終發(fā)展成肝癌。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是Ⅰ型跨膜蛋白，能識別侵入體內(nèi)的微生物進(jìn)而激活免疫細(xì)胞應(yīng)答，被認(rèn)為在先天性免疫系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用。據(jù)報道，TLRs家族中TLR3、TLR4、TLR7、TLR8及 TLR9與病毒感染性疾病密切相關(guān)［2］。本研究通過免疫組織化學(xué)及流式細(xì)胞術(shù)分別檢測原發(fā)性肝癌癌組織、相應(yīng)癌旁組織及肝血管瘤組織中TLR4、TLR9的表達(dá)，旨在探討二者在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 110例臨床病理診斷為原發(fā)性肝癌患者的癌組織及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，患者男93例，女17例，年齡22～74歲，平均52歲;血清學(xué)檢測證實患者均有乙肝感染史。同期肝血管瘤患者瘤組織標(biāo)本10份，患者男5例，女5例，年齡37～55歲，平均44歲;乙肝相關(guān)指標(biāo)均為陰性。主要試劑及儀器有PE-anti-human TLR4、PE-anti-human TLR9(eBio-sience公司)，小牛血清以及胎牛血清(杭州四季青公司)，消化酶(Clostridium histolyticum，Gibco，武漢天傲生物分裝)，1640培養(yǎng)液(Gibco公司)，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀(BD LSRⅡ，美國)，免疫組化TLR4、TLR9一抗(博士德生物工程，武漢/Abcam公司，美國)，免疫組化染色試劑盒Envision HRP兔鼠通用 二抗(上?；蚩萍?，NU-6613V31型－80℃低溫冰箱，Sigma 4 K15低溫離心機(Sigma，Germany)。

1.2 TLR4、TLR9水平檢測 ①免疫組化法:采用Elivision二步法進(jìn)行免疫組化染色，具體步驟參照試劑盒推薦步驟進(jìn)行，抗TLR4單克降抗體稀釋度為1∶100，抗 TLR9 單克降抗體稀釋度為 1∶50，DAB顯色，用檸檬酸微波法進(jìn)行抗原修復(fù)，以PBS代替抗體作為陰性對照組。采用綜合評分法，高倍鏡下隨機計數(shù)5個視野，計算陽性細(xì)胞所占百分比。陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例≤10%為0分，11% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，≥76%為4分;凡細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核呈淺棕色為1分、棕色為2分、深棕色為3分、不著色為0分。上述兩積分相乘:0分為陰性(－)、1～4分為弱陽性(+)、5～8分為中等陽性(++)、9～12分為強陽性(+++)，并以Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行組化圖像分析。②直接免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)(FCM):將獲取的新鮮肝癌、癌旁及肝血管瘤組織標(biāo)本剪成1 mm3組織塊，用無鈣、無鎂的D-Hank's液反復(fù)沖洗后加入膠原酶進(jìn)行消化，以用DMEM液終止膠原酶的作用。Facoll管中各自加入PE-anti-human TLR4抗體5μL、PE-anti-human TLR9抗體20μL和每管加入已計數(shù)的相應(yīng)細(xì)胞量，混勻，每管設(shè)陰性對照，按常規(guī)方法室溫、避光孵育30 min，4 mL PBS常溫1 200 g離心5 min/3次洗滌后，再加入0.5～1 mL PBS重懸，F(xiàn)CM上機檢測，并用Cellquest軟件分析TLR4、TLR9的平均熒光強度及陽性表達(dá)率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以ˉx±s表示，對計數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗和秩和檢驗，Spearman等級相關(guān)檢測相關(guān)性。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

免疫組化法示癌旁組織主要呈現(xiàn)出慢性炎癥及肝硬化的病理表現(xiàn)，TLR4及TLR9主要為漿/膜表達(dá)，而細(xì)胞核中無表達(dá)(圖1)。肝癌、癌旁及肝血管瘤組織中 TLR4表達(dá)陽性率分別為0.058 434、0.653 51、1，兩兩比較，P 均 ＜0.05;TLR9 表達(dá)陽性率分別為0.819 10、0.370 18、0.079 54，兩兩比較，P均＜0.05。FCM檢測與免疫組化染色法結(jié)果一致，見圖2。肝癌、癌旁及肝血管瘤組織中TLR4表達(dá)熒光強度分別為2 168、2 453、2 616，兩兩比較，P 均 ＜0.05;TLR9 表達(dá)分別為 2 280、1 907、1 428，兩兩比較，P 均 ＜0.05。

圖1 肝癌組織、癌旁組織、肝血管瘤組織中TLR4、TLR9表達(dá)(IHC ×200)

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎病毒感染所致的慢性肝炎和肝硬化是原發(fā)性肝癌最主要的因素，TLRs是參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質(zhì)分子，亦是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。TLRs通過識別病原相關(guān)分子模式(Pathogenassociated molecular patterns，PAMPs)及某些內(nèi)源性配體引發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的釋放，在天然免疫防御中起重要作用，并最終激活獲得性免疫系統(tǒng)。以往研究認(rèn)為TLRs主要表達(dá)于免疫細(xì)胞中，但越來越多的證據(jù)表明某些腫瘤細(xì)胞亦表達(dá)TLRs，TLRs參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活以及藥物敏感性［3，4］。

TLR4為TLR的一種，主要識別革蘭陰性菌脂多糖。新近研究發(fā)現(xiàn)，TLR4基因突變或基因多態(tài)性與肝癌的發(fā)生或惡性程度密切相關(guān)［5］。腫瘤組織在侵襲過程中可產(chǎn)生活性氧或應(yīng)激保護(hù)性因子，細(xì)胞壞死崩解釋放腫瘤抗原，所有的這些因子可成為TLR4的內(nèi)源性配體，從而激活TLR信號途徑，促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞的成熟，進(jìn)而活化T細(xì)胞引起特異性抗腫瘤免疫。TLR4信號途徑的激活有助于抗腫瘤免疫的啟動。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4在慢性肝炎患者的肝組織中表達(dá)上調(diào)，而TLR4在肝癌組織中較癌旁組織表達(dá)降低［6，7］。本研究發(fā)現(xiàn) TLR4在肝癌組織中表達(dá)低于癌旁及肝血管瘤組織，與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致。原因可能為HBV基因編碼的病毒蛋白發(fā)揮拮抗TLR介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答作用，乙肝病毒通過拮抗TLR4表達(dá)促進(jìn)肝癌的發(fā)生。

研究顯示，TLR9的外源性配體為細(xì)菌和病毒DNA中未甲基化的CpG序列，內(nèi)源性配體為含低甲基化CpG序列的自身DNA，亦是免疫細(xì)胞識別病毒和細(xì)菌中非甲基化DNA的必需成分。TLR9位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，UNC93B1同樣位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，激活以后，TLR9依賴UNC93B1的方式轉(zhuǎn)移到內(nèi)體/溶酶體，從而招募適配體蛋白MyD88，通過依賴MyD88的途徑激活I(lǐng)RF、AP-l、NF-κB 等轉(zhuǎn)錄因子，以產(chǎn)生大量的Ⅰ型干擾素和多種炎癥細(xì)胞因子，從而誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生和一系列免疫應(yīng)答機制，發(fā)揮免疫應(yīng)答效應(yīng)［8～10］。研究發(fā)現(xiàn)，TLR9除表達(dá)于正常上皮外，在腫瘤細(xì)胞中亦有表達(dá)，如乳腺癌、中樞系統(tǒng)腫瘤、肺癌、胃癌及前列腺癌等［11～15］。Tanaka 等［16］證實 TLR9 在 85.7%的肝癌組織中表達(dá)，利用CpG-ODN激活TLR9通路后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖加快，耐藥性增加，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)TLR9激活后凋亡抑制因子(Survivin、Bcl-xL、XIAP等)上調(diào)，而TLR9抑制劑處理后諸多相關(guān)癌基因下調(diào)。本研究結(jié)果顯示，TLR9在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織和肝血管瘤肝組織，提示乙肝病毒可能充當(dāng)外源性CpG相似的作用，激活TLR9通路并產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)，從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，TLR4、TLR9與肝癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，機制可能為乙肝病毒通過拮抗TLR4表達(dá)、激活TLR9通路促進(jìn)肝癌的進(jìn)展。

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