謝福利，翟惠虹

(1寧夏師范學院醫(yī)學院，寧夏固原756000;2寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院)

據(jù)報道［1～4］，鈣周期素結(jié)合蛋白(CacyBP/SIP)核轉(zhuǎn)位在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面均起促進作用，但機理目前尚不明確。有報道，表皮生長因子在結(jié)腸癌組織、癌周組織、癌遠側(cè)組織均有表達［5，6］，且隨腫瘤分期增加而表達增強，用其單克隆抗體處理LST174結(jié)腸癌細胞可見到一定程度的增殖抑制［7］。2010年7月～2011年9月，我們觀察了表皮生長因子對CacyBP/SIP過表達慢病毒載體轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌細胞CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 結(jié)腸癌SW480細胞購于上海中科院。L15培養(yǎng)基、小牛血清、胰酶購自Gibco公司;DAPI染色劑、表皮生長因子購于Sigma公司、胞質(zhì)胞核蛋白抽提試劑盒購于Pierce公司;CacyBP/SIP mAb購于Cell signaling;FITC標記的羊抗鼠IgG購自中山公司;Triton x-100裂解液試劑盒購自北京鼎國公司;PVDF膜購自Merck公司。

1.2 過表達CacyBP/SIP慢病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染應用人結(jié)腸癌細胞株HCT-116的cDNA序列，采用PrimerPremierv5.0軟件分別設計上游和下游引物;引物序列及用途見表1。應用PCR法擴增CacyBP/SIPcDNA序列。PCR擴增條件:94℃預變性5min;30次循環(huán):94℃變性30 s，55℃退火30s，72℃延伸1min;72℃總延伸10 min。PCR產(chǎn)物常規(guī)測序。帶有綠色熒光的慢病毒載體與目的基因分別用NheI和EcoRI進行雙酶切，T4連接酶將酶切后的產(chǎn)物相連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，應用PCR法篩選陽性克隆。PCR擴增條件:94℃預變性2min;30次循環(huán):94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min;72℃總延伸6min。接種陽性轉(zhuǎn)化子。對構(gòu)建載體的陽性克隆PCR結(jié)果電泳鑒定(圖1);進行測序與目標基因比對(圖2)。

表1 引物序列及用途

圖1 陽性克隆PCR電泳注:1:陰性對照(ddH2O);2:陰性對照(空載自連對照組);3:陽性對照(GAPDH);4:Marker:5kb，3kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp;5～12:CacyBP-1～8號轉(zhuǎn)化子

圖2 部分基因測序比對

將構(gòu)建好的帶有綠熒光蛋白的CacyBP-Lentivirus載體轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌SW480細胞:將人結(jié)腸癌細胞SW480細胞用含10%的56℃、30min熱滅活小牛血清的L15培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細胞長至80% ～90%傳代。至細胞在T50瓶長至30% ～50%時，每瓶加入Polybrene500μL(5μg/mL)、完全培養(yǎng)基4400μL和過表達CacyBP/SIP的慢病毒顆粒100μL(1×108)，在水平方向輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使之充分混勻，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)8～12h后觀察細胞狀態(tài)，棄去細胞上清，更換為新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞長至80%以上融合時，正常消化傳代。

1.3 表皮生長因子刺激及CacyBP/SIP在細胞內(nèi)定位和表達檢測 ①激光共聚焦顯微鏡法:取3個12孔培養(yǎng)板，每孔放置一個細胞爬片，每孔接種(3～4)×104個細胞于12孔板。待細胞長至最佳狀態(tài)時，吸干培養(yǎng)基，用PBS沖洗2次，每個培養(yǎng)板加入2mL含100ng/mL表皮生長因子培養(yǎng)基，對照組每孔分別加入完全培養(yǎng)基作為對照。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h。用4%多聚甲醛1mL，固定20min，PBS沖洗3遍，再用0.1%的 Tritont100，37℃溫箱內(nèi)打孔45 min，PBS沖洗3遍，最后用含DAPI封片劑染色封片。觀察刺激前后CacyBP/SIP在細胞中的定位。②Westernblot法:將轉(zhuǎn)染后的SW480細胞予100 ng/mL表皮生長因子刺激1h，胰酶消化后以500轉(zhuǎn)離心3min，取細胞沉淀用細胞質(zhì)蛋白、核蛋白抽提試劑盒分別抽提胞質(zhì)、胞核蛋白，用BCA試劑盒進行蛋白定量;上樣緩沖液稀釋至5μg/μL、煮沸后－80℃凍存;將20μL蛋白樣品上樣到12%SDSPAGE膠加樣孔內(nèi)，電泳電壓80V，時間20min;濕式轉(zhuǎn)膜，電流200mA，60min;加入5%脫脂牛奶封閉60min后，加入CacyBP/SIP單抗(1∶200)4℃孵育過夜，常規(guī)洗膜后加入羊抗鼠IgG(1∶2000)的二抗，室溫孵育1h，洗滌。曝光、顯影。檢測刺激前后CacyBP/SIP在細胞中的定位。

2 結(jié)果

激光共聚焦檢測結(jié)果顯示表皮生長因子刺激前CacyBP/SIP主要位于細胞胞質(zhì)內(nèi)，刺激1h后CacyBP/SIP轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi)(圖3)。Westernblot檢測結(jié)果顯示刺激前CacyBP/SIP主要在胞質(zhì)內(nèi)表達，刺激1h后可在細胞核內(nèi)表達(圖4)。

3 討論

圖3 激光共聚焦法檢測表皮生長因子刺激前、后CacyBP/SIP在細胞內(nèi)定位

圖4 Western blot檢測表皮生長因子刺激前、后CacyBP/SIP在細胞質(zhì)及細胞核中的表達

CacyBP/SIP相對分子質(zhì)量約為26kD，含一個687bp的開放閱讀框，編碼228個氨基酸，存在7個磷酸化位點和1個核定位信號［8］。CacyBP/SIP的C-末端可形成兩性α-螺旋，與S100蛋白家族的結(jié)構(gòu)域相似，C-末端(155-229)為S100蛋白結(jié)合域，N-末端(1-80)可與Siah-1結(jié)合，中間(73-155)即可與Skp1結(jié)合的區(qū)域［9］。目前對CacyBP/SIP功能的研究報道較少，其功能主要表現(xiàn)在以下兩方面:①與紅細胞有關(guān):據(jù)報道［10，11］，促紅細胞生成素受體活化可促進CacyBP/SIP表達上調(diào);②與p53有關(guān):參與新的泛素—蛋白酶體降解，當p53在細胞內(nèi)表達升高時，可誘導Siah-1基因表達［12］，共同組成泛素連接酶復合體 (Siah-1-CacyBP/SIP-SCF)，將未被磷酸化的β-catenin蛋白酶體降解。

以往研究發(fā)現(xiàn)，CacyBP/SIP在胃癌阿霉素耐藥細胞中高表達并參與胃癌細胞多藥耐藥，其下調(diào)可以部分逆轉(zhuǎn)耐藥性［13，14］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，CacyBP/SIP可抑制胃癌細胞的惡性表型，下調(diào)其表達能促進胃癌細胞的惡性表型，推測其通過促進癌細胞的凋亡和參與降解β-catenin影響靶分子的表達。但在腎細胞癌中發(fā)現(xiàn)，CacyBP/SIP表達上調(diào)能抑制腎細胞癌的增殖和腫瘤形成［15］。近年來又發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP參與乳腺癌、胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展及復發(fā)轉(zhuǎn)移，可能成為預后不良的生物學指標之一［16～19］。因此推斷CacyBP/SIP與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本課題組前期采用淋巴細胞雜交瘤技術(shù)制備了三株CacyBP/SIP單克隆抗體，對正常及腫瘤組織中CacyBP/SIP表達分布狀況做了較系統(tǒng)的研究［20，21］，發(fā)現(xiàn) CacyBP/SIP 在結(jié)腸癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，在正常結(jié)腸組織不表達，且主要定位于胞質(zhì)及胞核;予KCl刺激后，通過升高胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度，可誘導CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位。

表皮生長因子是1962年美國Cohen博士在實驗中偶然發(fā)現(xiàn)，是一類廣泛存在于人類和動物體內(nèi)的小分子多肽，不同種類動物的EGF氨基酸組成及結(jié)構(gòu)有一定差異，不同來源的表皮生長因子均能促進表皮細胞的分裂與增殖［22］，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。其基因在第4號染色體上(q25-q27)，約有 120 kb［23］，等電點(PI)為 4.6，相對分子質(zhì)量為6 045 Da，由53個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，含3個鏈內(nèi)二硫鍵［24］。有報道新型表皮生長因子受體抑制劑不管是單用還是與放療、化療聯(lián)合，均可提高患者生存率、延長緩解期［25］。

慢病毒載體是在HIV-1病毒基礎上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，其基因組是正鏈RNA，進入細胞后，在細胞質(zhì)中被其自身攜帶的反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)為DNA，形成DNA整合前復合體，進入細胞核后DNA整合到細胞基因組中。整合后的DNA轉(zhuǎn)錄mRNA，回到細胞質(zhì)中，表達目的蛋白。鑒于慢病毒載體具有轉(zhuǎn)染效率高、可穩(wěn)定長效表達、安全性高、可表達調(diào)控等優(yōu)點，我們構(gòu)建了CacyBP/SIP過表達慢病毒載體并將其轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌SW480細胞。激光共聚焦法及Western blot法均發(fā)現(xiàn)表皮生長因子刺激前CacyBP/SIP均主要定位于細胞胞質(zhì)，刺激后CacyBP/SIP可發(fā)生核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，Western blot檢測亦證實CacyBP/SIP在刺激前位于胞質(zhì)，刺激后部分位于胞核。

蛋白在細胞中的定位常與其功能密切相關(guān)，很多蛋白分子從無活性形式變?yōu)榛钚孕问綍r會發(fā)生分子定位的變化，進入到特定的亞細胞結(jié)構(gòu)中發(fā)揮其功能，其核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象提示其可能作為信號分子傳遞信息，從而參與細胞功能的調(diào)節(jié)。我們前期已發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP在結(jié)腸癌組織中高表達，免疫組化結(jié)果提示CacyBP/SIP位于胞質(zhì)及胞核，表皮生長因子可誘導CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位，關(guān)于CacyBP/SIP是否作為信使傳遞上游促進惡性腫瘤增殖的信號，尚需進一步研究。

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