孟祥奇，黃桂成

(南京中醫(yī)藥大學，南京215000)

骨關節(jié)炎是一類與年齡相關的退變性疾病，在軟骨再生和修復過程中失去動態(tài)平衡、關節(jié)炎癥及機械負重等因素均會加重病情［1～3］，治療棘手 。2011年3～10月，我們觀察了祛痰除濕劑對膝關節(jié)軟骨細胞 IL-1、IL-6、TNF-α mRNA 表達的影響，旨在探討祛痰除濕劑在骨關節(jié)炎治療中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF雄性10周齡SD大鼠30只，體質(zhì)量約300 g。培養(yǎng)箱(Espec BNA-31 1型)、倒置顯微鏡(Olympus U-RFCT50)、恒溫搖箱、低溫離心機(LXJ-1I型，上海醫(yī)療機械三廠)、Rotor Gene 3000型四通道PCR儀(澳大利亞Cobett公司);Mastercycler Personal型基因擴增儀(德國Eppendorf公司)。0.25%胰蛋白酶(Promega公司)、高糖DMEM(Gibco)、胎牛血清(杭州四季青公司)、TRizol試劑(美國Sigma公司);逆轉錄酶(北京天根生化科技有限公司);15份行人工膝關節(jié)置換術患者的病變膝關節(jié)軟骨組織標本(均用手術尖刀片削取關節(jié)表面軟骨，放入盛有PBS的培養(yǎng)皿中，清除表面血污及附著的其他組織)。IL-1、IL-6、TNF-α引物及內(nèi)參照 βactin引物序列(華大基因生物技術有限公司)。

1.2 含藥血清制備 將大鼠隨機分為對照組與給藥組各15只，分別制備空白生理鹽水(NS)血清和含藥血清。按體表面積折算動物的等效劑量，配成溶液，給藥組予祛痰除濕劑(含制南星、制川烏、薏苡仁、刺五加、丹參、地龍等中藥)2 mL/kg灌胃，對照組以生理鹽水2 mL/kg灌胃，均2次/d，連續(xù)3 d。末次灌胃1 h后分別采集兩組腹總動脈血，靜置1 h，2 000 r/min離心10 min，抽取血清，56 ℃水浴滅活30 min，經(jīng)0.22μm濾膜抽濾除菌，分裝，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 軟骨細胞分離培養(yǎng) 參照文獻［5］，用含青霉素鈉/慶大霉素雙抗液的PBS沖洗膝關節(jié)軟骨組織標本數(shù)次，移入超凈臺，將軟骨組織剪碎至約1 mm×1 mm×1 mm，均勻敷貼于半徑為5 cm培養(yǎng)皿底壁上，其中組織塊約占培養(yǎng)皿底1/3面積，加入DMEM培養(yǎng)基(含青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/L，20%胎牛血清)，置于37℃，體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。開始第4～5天組織貼壁后換液，以后隔天換液，第15～20天可見少量梭形、短梭形細胞散在分布于組織塊周圍，25 d左右可見細胞自融，1個月左右細胞長滿大部分(70% ～80%)培養(yǎng)皿底壁后棄舊培養(yǎng)液，用消毒無菌鑷子移除組織塊(組織塊可繼續(xù)加入20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)原代細胞)，用PBS液清洗3次，加入適量的0.25%胰蛋白酶，室溫下振蕩2～5 min。鏡下觀察貼壁細胞逐漸脫落，變成圓形，個別細胞開始浮游，加入新培養(yǎng)液，吹打混勻，離心1 000 r/min，5 min，收集細胞，接種培養(yǎng)，按1∶2比例傳代，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 含藥血清干預及 IL-1、IL-6、TNF-α mRNA 表達測定 取第三代傳代軟骨細胞等量置于6孔板中并分為 A、B、C、D、E、F、G 組。A 組加入 DMEM，B組加入5%祛痰除濕劑血清，C組加入5%NS血清，D組加入10%祛痰除濕劑血清，E組加入10%NS血清，F(xiàn)組加入20%祛痰除濕劑血清，G組加入20%NS 血清，繼續(xù)培養(yǎng)。分別于 4、8、24、48、72 h五個時間點采用Real Time-PCR法檢測IL-1、IL-6、TNF-αmRNA表達。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，計量數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，行方差齊性檢驗，多組樣本間比較采用單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

各組不同時間點軟骨細胞 IL-1、IL-6、TNF-α mRNA表達分別見表1、表2、表3。

表2 各組不同時間點軟骨細胞IL-6 mRNA表達(ˉx±s)

表3 各組不同時間點軟骨細胞TNF-αmRNA表達(ˉx±s)

3 討論

骨關節(jié)炎是一種以關節(jié)軟骨退行性改變?yōu)橹行?，累及關節(jié)及關節(jié)其他結構的慢性炎癥。鑒于關節(jié)軟骨退變是骨關節(jié)炎的最直接原因，故目前對骨關節(jié)炎的實驗研究多集中于對關節(jié)軟骨退變的研究上。目前骨關節(jié)炎的發(fā)病機理仍不十分清楚。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖、運動不當、氣候不佳和不良的生活習慣等外界因素，內(nèi)分泌紊亂，損傷，免疫學異常，細胞凋亡，細胞因子及酶的作用等均可引發(fā)關節(jié)軟骨退變［4］。

近年來發(fā)現(xiàn)，關節(jié)滑膜細胞及軟骨細胞自身在受到不同刺激出現(xiàn)損傷或炎癥時，可產(chǎn)生大量細胞因子，其中IL-1、IL-6、TNF-α 等均為炎性因子，不僅能促進單核巨噬細胞與粒細胞吞噬趨化，釋放溶酶體酶、氧自由基、組胺等，導致軟骨基質(zhì)降解，還可誘導T細胞和B細胞活化，加重免疫損傷［6］。Goldring等［7］發(fā)現(xiàn)，IL-1、IL-6、TNF-α 在軟骨及滑膜中表達增高與炎癥破壞及炎癥反應的嚴重程度呈正相關。據(jù)報道，膝骨關節(jié)炎患者血清中 IL-1、IL-6、TNF-α明顯升高。IL-6可增加滑膜組織的炎癥細胞、刺激軟骨細胞增殖，誘導放大IL-1，增加MMPs的合成作用，抑制蛋白多糖產(chǎn)生，但由于IL-6能誘導TIMP的產(chǎn)生，而不是MMPs，故此因子被認為與限制蛋白分解損傷的負反饋機制有關。TNF-α導致關節(jié)病變的可能機制是:①刺激滑膜細胞與軟骨細胞合成PGE2和膠原酶，刺激血管擴張滲出，促進破骨細胞的溶骨作用，造成關節(jié)破壞;②促進軟骨細胞合成與分泌MMPs，引起軟骨的吸收降解破壞，促使成纖維細胞增生;③對創(chuàng)傷局部血管內(nèi)皮細胞發(fā)揮多方面的作用，包括激活和損傷作用，血管內(nèi)皮細胞經(jīng)TNF-α刺激后，可產(chǎn)生形態(tài)和功能變化，使其通透性增加，加重局部組織炎性水腫和炎性細胞浸潤。

骨關節(jié)炎的中醫(yī)病機辨證是“氣虛血瘀，本虛標實，痰濕阻滯”。祛痰除濕劑由制南星、丹參、薏苡仁等中藥組成，由經(jīng)典成藥小活絡丹化裁而來。制南星燥濕化痰，祛風止痙，還具有散結消腫的作用;薏苡仁可利水滲濕，健脾除痹。對細胞免疫、體液免疫有促進作用，還能降血鈣、延緩衰老，提高機體的免疫能力;制川烏能祛除寒濕，溫經(jīng)止痛;刺五加祛風濕，強筋骨，還能利水腫。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明丹參具有活血祛瘀，涼血消癰，除煩安神作用，其有效成分丹參酮等能抑制血小板黏附聚集和血栓形成，降低血液黏度和骨內(nèi)高壓，提高關節(jié)軟骨超氧化物歧化酶活性，從而能更有效地清除氧自由基，延緩關節(jié)軟骨的退行性變等作用。可見祛痰除濕劑是通過多系統(tǒng)和多靶點發(fā)揮治療作用。本研究結果表明，采用祛痰除濕劑含藥血清干預后，退變軟骨細胞中 IL-1、IL-6、TNF-α mRNA 表達均下調(diào)，以 10%祛痰除濕劑含藥血清作用最明顯，IL-1、IL-6、TNF-α mRNA分別于10%祛痰除濕劑含藥血清作用8、24、48 h后降至最低。據(jù)報道，中藥復方血清藥理實驗中體外培養(yǎng)液中的含藥血清濃度以臨床等效劑量為基準，其中10%較為合適，一般不超過20%，過高或過低均不宜［8］。本研究為探索性實驗，結果顯示以10%含藥血清濃度效果最好，與文獻［8］報道一致，此為祛痰除濕劑臨床等效劑量治療骨關節(jié)炎提供了可靠實驗依據(jù)。

本研究結果提示，10%祛痰除濕劑含藥血清可能通過影響膝關節(jié)軟骨中IL-1、IL-6、TNF-α及相關代謝酶mRNA表達而及減輕炎癥反應，延緩關節(jié)軟骨細胞的退變。但本實驗由于受實驗條件和技術水平限制，且正常人的軟骨組織取材較困難，故缺乏正常的關節(jié)軟骨細胞作對照，具體的作用機制尚有待進一步深入研究。

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