劉建營，曹長仁，謝水華，樊福好

（農業(yè)部種豬質量監(jiān)督檢驗測試中心（廣州)，廣州 430070）

在現代養(yǎng)豬生產中，人們已經越來越不依賴于眼觀和僅僅憑借經驗來判斷豬病了。那種認為“皮膚有出血點就是豬瘟”，“肝臟有壞死白點就是偽狂犬病”，“出現間質性肺炎就是弓形蟲”，“出現腹瀉不是PED就是TGE”等等觀點早已被行業(yè)所拋棄。

血液學的檢測技術在當前的養(yǎng)豬生產中已經顯得越來越重要。為指導養(yǎng)豬生產提供更加科學的依據，為疫苗接種提供更加準確的評價標準，為飼養(yǎng)管理方式的采用和變更提供更加詳實的數據，實驗室檢測結果的判定和數據分析技術越來越受到廣大科技工作者和養(yǎng)豬生產者的關注，本文擬對此進行簡述，以期拋磚引玉。

1 血液樣本的采集

豬的血液采集部位一般選擇在耳靜脈、頸靜脈和前腔靜脈進行。耳靜脈采血雖然方便，但采血量不足；頸靜脈和前腔靜脈對采血的技術要求較高，一般難以掌握，但一旦掌握技巧，采血的速度將非常迅速，常在幾秒鐘內即可完成。

過去采血一般使用注射器直接采集，但采集的血液容易受到污染，容易導致紅細胞破裂和出現脂血的問題，大大地影響檢測結果。

建議采用血液保護液（blood protesis?）進行采血，具體步驟是:用注射器采集血液保護液約2 mL，然后采集血液約2 mL，輕度混勻。此時采集的血液上清為無色狀態(tài)而非淡黃色狀態(tài)，這些血液樣本大大利于進行ELISA、PCR和血液生理生化的檢測。

在進行血液檢測工作之前，首先要確定采集的樣本量。按照生物統計學的原理，應該采用分層采樣（stratified sampling，又稱分類抽樣或類型抽樣，先將總體樣本中全部個體按某種特征分成若干層，再從每一層內隨機抽取一定數量的個體組成樣本）的方法。即首先確定一個類別群體，比如公豬群、經產母豬群、哺乳仔豬群、保育豬群、生長豬群，等等。

通過抽樣確定總體樣本的屬性，要考慮檢測誤差、檢測結果的估計標準差和置信區(qū)間來確定樣本量，如在豬瘟抗體檢測中，容許誤差為5，標準差為15，置信區(qū)間取95%，根據N=（1.96*標準差/誤差）2，則樣本量為35。即：容許誤差越小，估計標準差越大，置信區(qū)間越大，所需樣本量越大。

根據經驗，按照現行市面上通用的檢測試劑盒的特異性和敏感性以及檢測結果的估計標準差計算，每個群體（即采樣層）需要采集樣本約30份左右為宜。采樣時，必須遵循隨機抽樣（random sampling）的原則。

2 抗體檢測及數據分析

在過去的曾經一段時間內，豬血液中的抗體（antibody）檢測一直采用間接血凝試驗（indirect hemagglutination assay，IHA），但該方法操作繁雜，誤差較大，已經被大多數實驗室所棄用（如豬瘟抗體的檢測）；而市面上的免疫金試驗由于誤差較大，不能量化，結果不可信，推廣難度就顯得較大。目前大多數實驗室采用的檢測抗體的方式是酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，簡稱ELISA），該方法操作規(guī)范，結果可靠，數據可通過計算機存儲并便于分析。在進行ELISA檢測時，要注意的幾個事項是：孵育溫度要準確、洗板力度要適宜、陰陽性對照均需要分別設立至少2份以上（很多實驗室采用一孔進行陰性或陽性對照來節(jié)省檢測成本的做法是不推薦的），采用保護液采集的血液樣本要換算稀釋倍數。

1)通過ELISA方法檢測獲得的抗體結果分為3種：陽性（positive）、陰性（negative）和可疑（suspect）（某些試劑盒未設置可疑結果）。由于這3種結果在本質上是完全不同的，在分析結果時要分類計算（classified counting），不可混合分析。比如：

陽性率=陽性結果數/檢測樣本總數。

平均值=陽性結果總和/陽性結果樣本總數（而非總樣本數）。

陰性結果無論數值大小，均應歸至某一定值：如在豬瘟的抗體檢測中，阻斷率大于40為陽性，30～40之間為可疑，30以下為陰性。假定3個樣本的檢測結果分別為20、20、5，則這3個結果均應歸為0，因為20、20和5的意義和0是相同的，他們之間并不存在抗體含量在數值上的差異。即這3個樣本的抗體平均值為0，而不是15[原計算方法是：(20+20+5)/5=15]。

2)另外，為了實現不同實驗室和不同檢測方法之間的比較，建議盡量采用相對抗體法（relative antibody titer）而不是絕對抗體法來標示抗體的高低。表1中筆者采用了相對抗體法和歸零法標示了20份樣本的豬瘟抗體水平。

表1 豬瘟抗體水平標示

3)相對抗體的采用還具有另外一個優(yōu)點，就是可以用來評價疫苗的免疫效力。疫苗的免疫效力（immune efficacy index）的計算公式為：

免疫效力=抗體陽性率與相對抗體平均值乘積的平方根

表2是筆者所在實驗室計算所得2006-2012年各個年度的豬瘟抗體陽性率，相對抗體平均值以及免疫效力（年檢測樣本量均在5萬份以上，2012年僅取上半年數據）。

表2 2006－2012年的豬瘟抗體陽性率、相對抗體平均值及免疫效力 /%

表3 某商品豬瘟疫苗的臨床應用結果及效果評價

經過計算得知（見表3），該疫苗接種豬群后，陽性率為100%，相對抗體的平均值為94.4%，疫苗的免疫效力為97.2%，該疫苗是豬用疫苗市場中比較理想的豬瘟疫苗之一。

3 抗原檢測

抗原（antigen）的檢測方法與抗體檢測有所相似，但目前抗原檢測試劑盒大多數存在一定的不足之處，如可重復性差、存在較多的假陽性（false positive rate）或假陰性（false negative rate）結果、樣品處理難度高，等等。

不過，用于檢測藥物殘留的試劑盒在質量上已經獲得了不小的進展。

通過ELISA的方法甚至可以測試疫苗中的抗原含量，從而評定疫苗效果的優(yōu)劣。表4是筆者所在的實驗室所進行的一項檢測。疫苗均來自于疫苗銷售的門店。

從表4中可以看出，品牌1的效果明顯優(yōu)于其他幾個品牌，品牌5雖然抗原量尚可，但其中的雜質較多，低稀釋倍數影響了抗原的檢測；而品牌3、品牌6和品牌7則僅僅檢測出豬瘟疫苗抗原的可疑結果，未出現陽性結果。

當然，評價活疫苗抗原含量的方式還可以通過定量基因檢測來確定。

4 基因檢測

很多人把基因檢測（gene detection）混同于抗原檢測，這是一種理解上的誤差?；驒z測主要用于活的病原體的檢測，即檢測病原體的核酸（DNA和RNA）。核酸檢測的制約性因素主要是核酸的提取以及純化，若核酸降解或核酸被多糖以及蛋白質污染，則很容易出現陰性結果。因此，各實驗室必須在核酸的純化上多下功夫，不能單純依賴試劑盒。

表4 疫苗中的抗原含量檢測

核酸檢測的基本步驟包括：核酸釋放，核酸純化，核酸擴增。核酸擴增的方法通常采用聚合酶鏈式反應（簡稱PCR），根據核酸的性質分為RT-PCR（用于檢測RNA）和PCR（用于檢測DNA）2種。

由于PCR反應同時具備很高的敏感性，也極易出現假陽性的結果。因此，必須防止提純的核酸被實驗室內其他核酸的污染，盡量采用高度潔凈實驗室進行核酸的擴增試驗。

5 健康評價及數據分析

1）健康評價（health evaluation）是一項針對機體健康狀態(tài)的量化評價技術，現已在中國各地陸續(xù)開展，包括豬、牛、兔子、狗、貓、猴子等。健康評價的原理是通過檢測血液中的生理、生化指標，并通過數學模型分析生理、生化指標的相關性，導出機體的健康指數等一系列指標來量化機體的健康狀態(tài)。健康評價是對抗原、抗體檢測以及基因檢測的一個良好補充，前者針對機體，后者針對病原體，體現了事物的2個方面。

營養(yǎng)不良：機體營養(yǎng)物質吸收障礙或營養(yǎng)物質供應不足或供應不平衡，均會導致營養(yǎng)不良或營養(yǎng)失調（malnutrition）狀態(tài)。正常機體的營養(yǎng)不良指數為0，否則，營養(yǎng)不良指數越高，機體的營養(yǎng)不良狀態(tài)越嚴重。營養(yǎng)不良的典型臨床癥狀是機體皮膚蒼白、毛長、消瘦。

中毒：中毒（toxic）是機體的一種狀態(tài)，可以通過中毒指數來衡量，正常機體為0。導致中毒的因素包括藥物中毒，金屬物中毒，霉菌毒素中毒和代謝性中毒。如機體肝臟和腎臟受損時，代謝物不易排出體外，則出現中毒狀態(tài)。中毒與臨床表現不具備相關性，甚至有些中毒的機體可以表現良好的生產性能。另外，機體發(fā)生中毒時，建議適當補充維生素B12和葉酸，增強機體的排毒能力。

免疫抑制（immunosuppresion）：當機體長期處在中毒狀態(tài)或受到病毒感染時，則出現免疫抑制。出現免疫抑制的機體對于疫苗接種反應不良。

炎癥（inflammation）：正常機體的炎癥指數為0。炎癥的出現與機體的臨床表現有一定的相關性。機體長期處于炎癥狀態(tài)時，還會導致血液分布指數下降，影響豬群的生長發(fā)育。嚴重的炎癥反應使豬體重不增反降，此所謂“炎多必失”。

血液分布（blood distribution）：血液分布與機體的抵抗力傳輸和營養(yǎng)物質分配具有直接的關系。正常機體的血液分布指數在80～100之間。血液分布指數過低，營養(yǎng)物質分配不足，嚴重時甚至出現高度發(fā)育不良（即僵豬）。血液分布指數過高，則機體的抵抗力傳輸失衡，往往導致豬只死亡。

健康指數：健康指數（health index）是機體健康狀態(tài)的綜合指標。100以上為健康狀態(tài)，70以下為病理狀態(tài)；70～100之間為亞健康狀態(tài)。

表5中的3頭豬均出現營養(yǎng)不良狀態(tài)，原因是使用了質量低下的豆粕造成，此時出現炎癥反應亦當容易理解。

表6中，母豬出現中毒狀態(tài)，從而導致哺乳仔豬也出現中毒狀態(tài)；到了斷奶后，保育豬出現營養(yǎng)不良狀態(tài)。所以，飼料的質量事關養(yǎng)豬生產的成敗得失。

表5 3頭豬的健康評價

表6 健康評價案例

必須強調的是：懷孕母豬的中毒狀態(tài)對仔豬的影響很大，會導致仔豬的健康狀態(tài)不佳。若母豬奶水有毒素排出，則仔豬吮乳后會出現腹瀉。若仔豬在懷孕期間肝、腎受到損傷，則這些仔豬出生后會出現生長發(fā)育不良狀態(tài)，呼吸道問題也會接二連三地發(fā)生。尤其強調的是，不僅僅是母豬奶水的數量，母豬奶水的質量對仔豬影響更大，這一點必須重視。

2）豬群本身的健康問題主要來源于2個方面：豬采食量不足或過多。采食量不足或采食量過度，機體均會出現一系列的臨床問題，如皮膚蒼白或皮膚潮紅、毛孔出血、眼角下出現“淚斑”。對于發(fā)生的營養(yǎng)不良問題，可以通過增加采食量或平衡日糧來解決。采食和飲水功能的恰如其分（即不偏不倚）對于維持豬群的健康至關重要，此所謂“舌尖上的幸福”（happiness from a bite），豬群的“舌尖上的幸?！笔秋暳蠣I養(yǎng)行業(yè)必須給予足夠研究和關注的內容，也將成為涉及人類食品安全的重要內容。

在生產過程中，保持采食和排泄的平衡狀態(tài)，動物可以維持健康狀態(tài)。

在日常的生產情況下，體內產生的毒素和代謝產物主要通過機體增強血液分布能力，經過尿液或糞便等途徑排出；而在病理的情況下，毒素則通過嘔吐、腹瀉、流產和乳汁等途徑排泄。

尿液和糞便對于機體的健康維持有著舉足輕重的作用，保持尿液和糞便排泄的暢通對于健康管理的順利實施有重要的理論意義和實踐意義。在營養(yǎng)并不缺乏的環(huán)境條件下，尿道和肛門這兩個通道對于機體的“幸福生活”的作用非同凡響，此所謂“襠下的幸?！保╤appiness between legs）。

晉朝學者傅玄在他的一篇名為《口銘》的文中指出：“病從口入，禍從口出。”

何謂“口”，口即機體通向體外的孔竅。包括毛孔、口腔，鼻腔，眼睛，耳朵，尿道和肛門，尤其尿道和肛門在機體毒物排泄中起著重要的作用。尿液通過尿道，糞便通過肛門排泄機體的代謝產物，若此功能受到影響，將最終影響機體的正常生理機能。

所以，若尿液和糞便排泄正常，則機體機能才能維持一種理想的狀態(tài)，此即“襠下的幸?！?。那么，如何才能維持這種 “襠下的幸?！蹦?？參見①、②、③敘述。

①維持正常的腎臟功能。在當前的養(yǎng)豬生產管理過程中，由于大量使用金屬類添加劑和磺胺類等藥物，肝臟的功能嚴重受損，加之環(huán)狀病毒等病毒的感染，后果更加嚴重，機體通過尿液排泄毒物的功能大打折扣，甚至完全失去毒物的排泄能力，尿毒癥隨即發(fā)生。

降低飼料中的金屬類、磺胺類添加物對于維持腎臟功能有較大的作用。

另外，一些中草藥對腎臟功能同樣有影響，不能“迷信”中草藥的功效。如雷公藤、草烏、益母草、蓖麻子、麻黃、北豆根、巴豆、荊芥、牛膝、蘆薈和蒼耳子等會引起腎衰。近年報道，茴香桔梗丸、云南白藥、葛根素注射液、復方丹參注射液等中成藥也可引起急性腎衰。

②維持正常的肝臟功能。肝臟可以通過一系列的生化反應來代謝進入機體的物質，但是，肝臟功能同樣會受到霉菌毒素等物質的抑制，若肝臟受到病原體感染，則肝臟的解毒功能同樣也會下降。

另外，除了用于完成解毒功能以外，肝臟產生的一系列因子（血漿蛋白、凝血因子）可以用于維持機體的正常血液分布。若血液分布的平衡狀態(tài)改變，則容易出現胸水、腹水和心包積液等病癥，類似于所謂“豬副嗜血桿菌感染”(Glasser’s diseases）的那種狀態(tài)。即：肝臟功能受損，血漿蛋白合成障礙，血液通透性增加，心包和胸腔積液增加，腹腔積液增加，白細胞滲出增加，自身免疫反應增強，進而發(fā)生心包炎、胸膜炎和腹膜炎，即所謂的“包心”、“包肺”和“包腸”。

③維持正常的肺臟功能。肺臟在機體的水分代謝中也起著非常重要的作用。若肺部感染嚴重，則機體通過肺部散發(fā)的水分過多，則腸道干燥，發(fā)生便秘，機體毒物蓄積嚴重。所以，保持肺部的清潔空氣流通，防止肺部感染同樣非常重要。因此，建造豬舍時，必須充分考慮通風措施的落實，降低飼養(yǎng)密度，實施“適度分散、農牧結合”（agriculture & scattering pig-raising）的飼養(yǎng)管理模式。所以，肺部的正常功能維持也與“襠下的幸?！毕⑾⑾嚓P。

6 總結

總之，豬血液的實驗室檢測是一項大的系統工程，不能追求那種一蹴而就的效果。實驗室檢測的對象包括病因和機體2個方面，二者缺一不可。實驗室檢測要遵循連續(xù)性原則，“平時不燒香，臨時抱佛腳”的思想是要不得的，不能等農場（豬場）出了問題才進行檢測，此時則為時晚矣。

另外，中國的養(yǎng)豬企業(yè)要避免“大而全”的思想，一個存欄1000～2000頭左右母豬的農場沒有必要建立一個“五臟俱全”的實驗室，可以委托相關的科研機構和院校，實現資源共享。而大型或超大型的養(yǎng)豬企業(yè)可考慮獨立建立實驗室或聯合建立區(qū)域性實驗室，方便采樣、檢測以及便于進行商業(yè)性知識產權保護工作。

（略）