朱世楊張小玲羅天寬劉慶唐征荊贊革

（溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙南作物育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江溫州 325006）

土壤鹽堿化是世界性的環(huán)境問(wèn)題，已成為限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要障礙因子（楊小環(huán) 等，2011）。全世界鹽漬土壤面積約占陸地面積的7.6%，我國(guó)鹽漬土壤面積約有0.7億hm2（李源 等，2010），并且隨著工業(yè)污水的任意排放，化肥的盲目增施及土壤的不科學(xué)管理，土壤鹽堿化面積仍在進(jìn)一步的擴(kuò)大。如何開(kāi)發(fā)利用如此大面積的鹽堿地資源，對(duì)發(fā)展國(guó)民經(jīng)濟(jì)有著重要的戰(zhàn)略意義。花椰菜（Brassica oleraceaL.var.botrytisL.）為十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種的一個(gè)變種，其營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美，具有抗癌防癌功效，在浙江、江蘇、甘肅、河南等地均有種植，是人們餐桌上重要的蔬菜作物之一（陳珍，2009）?，F(xiàn)階段加強(qiáng)花椰菜鹽脅迫的生理生態(tài)機(jī)制研究，對(duì)其在灘涂鹽堿地的開(kāi)發(fā)種植，為廣大老百姓提供高品質(zhì)健康蔬菜具有重要的指導(dǎo)意義；對(duì)開(kāi)展花椰菜耐鹽種質(zhì)資源評(píng)價(jià)及抗鹽品種選育亦具有深遠(yuǎn)的參考價(jià)值。前人對(duì)向日葵（Mehmet et al.，2006）、苜蓿（Wang & Han，2009）和秋葵（Dkhil & Denden，2010）等植物鹽脅迫的研究較多。關(guān)于花椰菜，前人在干旱脅迫（陳國(guó)菊 等，2002）、高溫脅迫（汪炳良 等，2004）和重金屬脅迫（陳珍，2009）方面有少許研究報(bào)道，但花椰菜鹽脅迫的生理生化研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)初步研究了不同濃度NaCl脅迫強(qiáng)度對(duì)花椰菜種子活力和抗氧化酶活性及幼苗光合色素的變化特點(diǎn)，旨在探討花椰菜萌發(fā)期鹽脅迫的生理生化機(jī)制，為花椰菜鹽堿地開(kāi)發(fā)利用及耐鹽種質(zhì)篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為2009年5月采收的花椰菜銀農(nóng)70天自交系種子（10 ℃冰箱中貯藏），由溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院生物工程技術(shù)研究所花椰菜課題組提供。試驗(yàn)于2009年12月在本課題組的培養(yǎng)室和細(xì)胞與基因工程研究室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

用雙蒸餾水和分析純 NaCl配制 34、68、102、136、170、204 mmol·L-1的 NaCl處理液，對(duì)照為雙蒸餾水（0 mmol·L-1）。將兩層濾紙墊入培養(yǎng)皿（Φ=9 cm），加入3 mL NaCl處理液使濾紙飽和吸水后作為發(fā)芽床。選取 100粒發(fā)育飽滿的種子整齊排列于發(fā)芽床上，培養(yǎng)皿蓋上蓋后置于全自動(dòng)控制的培養(yǎng)室（杭州求是人工氣候環(huán)境有限公司設(shè)計(jì)和安裝）中連續(xù)培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)室溫度設(shè)置為25 ℃，每天光照12 h，黑暗12 h。每天定時(shí)更換濾紙和鹽溶液，以保持各處理NaCl濃度不變。發(fā)芽試驗(yàn)4次重復(fù)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.3.1 種子活力測(cè)定 種子萌發(fā)期間，每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽的種子數(shù)，2 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，7 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率并測(cè)定幼苗鮮質(zhì)量和干質(zhì)量（每個(gè)處理每次重復(fù)測(cè)定 10株）。發(fā)芽指數(shù)和相對(duì)鹽害率參考苗春樂(lè)等（2008）的方法。

Gt為第t天發(fā)芽的種子數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

1.3.2 抗氧化酶活性和丙二醛（MDA）含量測(cè)定 超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛含量測(cè)定每個(gè)處理 3次重復(fù)。酶液提取參考 Zhu等（2010）的方法，稱取30粒種子置于相應(yīng)NaCl處理液中25 ℃萌動(dòng)24 h后，在-20 ℃預(yù)冷的研缽中用6 mL 0.05 mol·L-1pH 7.0磷酸緩沖液研磨成勻漿，然后將提取液15 000 r·min-14 ℃離心20 min，上清液即為酶粗提液，用于SOD、POD和CAT活性及MDA含量的測(cè)定（李合生，2000）。

1.3.3 光合色素含量的測(cè)定 光合色素含量測(cè)定每個(gè)處理3次重復(fù)。取發(fā)芽7 d幼苗子葉0.5 g置于丙酮酒精溶液（乙醇∶丙酮∶H2O=9V∶9V∶2V）中，25 ℃黑暗條件下浸提72 h，浸提液用Unico UV-2802PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）和類胡蘿卜素（Car）含量，并計(jì)算總的葉綠素含量（Chl）=Chla+Chlb和葉綠素a/b（Chla/Chlb）及Car/Chl的值（李合生，2000；王建成 等，2004）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對(duì)不同 NaCl脅迫濃度下各指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），平均值之間的比較采用LSD檢驗(yàn)；并對(duì)各參數(shù)在 NaCl脅迫濃度梯度上的變化趨勢(shì)進(jìn)行曲線擬合。所有數(shù)據(jù)分析采用Microsoft Excel 2003和方差分析軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同NaCl脅迫濃度對(duì)花椰菜種子活力和幼苗干鮮質(zhì)量的影響

在NaCl脅迫濃度梯度上，花椰菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)變化趨勢(shì)基本一致，都隨NaCl脅迫強(qiáng)度增加呈線性降低趨勢(shì)（圖1）。發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)在34～68 mmol·L-1NaCl脅迫下與對(duì)照無(wú)顯著差異，但102～204 mmol·L-1NaCl脅迫下隨NaCl濃度增加顯著降低。相對(duì)鹽害率在NaCl脅迫濃度梯度上呈“倒鐘形”拋物線變化（圖1），其中34 mmol·L-1NaCl脅迫下出現(xiàn)最小值，而102～204 mmol·L-1NaCl脅迫下則比對(duì)照顯著增加了8.2%～95.7%。幼苗鮮質(zhì)量和干質(zhì)量隨NaCl脅迫濃度呈拋物線變化規(guī)律（圖1），NaCl濃度為68 mmol·L-1時(shí)出現(xiàn)最大值，分別為42.75、4.50 mg·株-1；在34～102 mmol·L-1NaCl脅迫下幼苗鮮質(zhì)量和干質(zhì)量分別較對(duì)照增加21.4%～26.6%和21.7%～36.8%，而136～170 mmol·L-1NaCl脅迫下則分別降低15.6%～26.0%和9.5%～32.5%。

2.2 不同NaCl脅迫濃度對(duì)花椰菜種子抗氧化酶活性和MDA含量的影響

圖2顯示了不同NaCl脅迫濃度下花椰菜種子抗氧化酶活性和MDA含量的變化情況。由圖2可以看出，不同抗氧化酶活性在NaCl脅迫濃度梯度上的變化趨勢(shì)有所不同。SOD活性隨NaCl脅迫濃度梯度遞增呈“鐘形”拋物線變化規(guī)律，102 mmol·L-1NaCl脅迫下SOD活性最高，比對(duì)照提高了83.8%；而204 mmol·L-1NaCl脅迫下SOD活性則降低了28.4%，差異極顯著。在NaCl脅迫濃度梯度上POD與CAT活性表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)，呈多項(xiàng)式變化特點(diǎn)，且均在136 mmol·L-1NaCl脅迫下活性最高，分別比對(duì)照升高了31.1%和41.5%；而204 mmol·L-1NaCl脅迫下則分別降低了 44.2%和 51.9%，差異極顯著。MDA含量隨 NaCl脅迫濃度增強(qiáng)呈線性遞增趨勢(shì)，而且NaCl脅迫濃度越大，MDA含量增加幅度越大，尤其102～204 mmol·L NaCl脅迫下MDA含量比對(duì)照增加1.4～3.6倍，差異極顯著。

圖1 不同NaCl脅迫濃度下花椰菜種子活力、幼苗干質(zhì)量和鮮質(zhì)量的變化

圖2 不同NaCl脅迫濃度下花椰菜種子SOD、POD、CAT活性和MDA含量的變化

2.3 不同NaCl脅迫濃度對(duì)花椰菜幼苗光合色素含量的影響

由圖3可看出，花椰菜幼苗子葉中Chla、Chlb、Chl和Car含量隨NaCl脅迫濃度遞增呈拋物線變化；其中Chla、Chlb和Chl含量于102 mmol·L-1NaCl脅迫下出現(xiàn)峰值，分別為7.85、3.82、11.67 mg·g-1（FW），比對(duì)照增加了58.4%、87.4%和66.9%，差異極顯著；Car含量則于68 mmol·L-1NaCl脅迫下出現(xiàn)峰值，為1.26 mg·g-1（FW），較對(duì)照增加了39.5%，差異極顯著。Chla/Chlb和Car/Chl值在NaCl脅迫濃度梯度上呈線性降低趨勢(shì)（圖3），在34～170 mmol·L-1NaCl脅迫下，Chla/Chlb和Car/Chl值分別比對(duì)照降低6.7%～23.2%和12.2%～38.9%。

圖3 不同NaCl脅迫濃度下花椰菜幼苗子葉中Chla、Chlb、Chl和Car含量及Chla/Chlb和Car/Chl值的變化

3 結(jié)論與討論

種子萌發(fā)期是植物生活史中最為關(guān)鍵的生長(zhǎng)階段，也是其生活史中抗逆性最為薄弱的一個(gè)環(huán)節(jié)（Pujari & Chanda，2002）。鹽脅迫對(duì)植物種子造成毒害，降低了種子的發(fā)芽率和發(fā)芽速度，影響了幼苗的生長(zhǎng)和發(fā)育（喬紹俊 等，2009）。本試驗(yàn)中，花椰菜種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)隨鹽脅迫濃度增加呈線性降低變化規(guī)律，其中34～68 mmol·L-1NaCl脅迫下各發(fā)芽指標(biāo)較對(duì)照無(wú)顯著差異，但 136～204 mmol·L-1NaCl脅迫下卻極顯著降低；相對(duì)鹽害率在 102～204 mmol·L-1NaCl脅迫下明顯增加；幼苗干、鮮質(zhì)量雖在34～102 mmol·L-1NaCl脅迫下有所提高，但136～170 mmol·L-1NaCl脅迫下顯著降低。這可能與高濃度NaCl導(dǎo)致種子吸水受抑制而影響種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)有關(guān)，亦可能與高濃度NaCl引起的離子毒害作用有關(guān)。這與李建設(shè)等（2009）在燕麥鹽脅迫研究中的發(fā)現(xiàn)類似。

Chla、Chlb、Chl和Car是植物主要的光合色素，它們的含量和比例是反映光合能力的重要指標(biāo)；Car還是內(nèi)源抗氧化劑，具有抗氧化功能，能夠防止細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用（陳健妙 等，2009；秦景 等，2009）。本試驗(yàn)中，不同NaCl脅迫濃度梯度下，花椰菜幼苗子葉中4種光合色素的含量變化規(guī)律一致，在 NaCl脅迫濃度梯度上均呈拋物線的變化趨勢(shì)?？赡苁堑蜐舛?NaCl脅迫下花椰菜通過(guò)增加光合色素合成以提高自身的抗鹽性，而高濃度NaCl脅迫強(qiáng)度下光合色素合成受阻，降解加快，從而導(dǎo)致光合色素含量迅速下降。同時(shí)，高濃度NaCl脅迫下Car含量的降低也抑制了其對(duì)活性氧自由基的清除作用，進(jìn)一步加劇了葉綠體膜的破壞，造成葉綠素的快速降解，進(jìn)而影響到葉片的光合能力（陳健妙 等，2009；秦景 等，2009）?；ㄒ擞酌绺?、鮮質(zhì)量在 NaCl脅迫下的變化趨勢(shì)或許與光合色素的變化特點(diǎn)有關(guān)。這與前人在沙棘（秦景 等，2009）、麻風(fēng)樹(shù)（陳健妙 等，2009）鹽脅迫研究中的發(fā)現(xiàn)相一致。Chla/Chlb值的變化能反映植物光合活性的強(qiáng)弱（秦景 等，2009），Car/Chl值與植物清除活性氧能力和忍受逆境能力有關(guān)（陳健妙 等，2009）。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Chla/Chlb和Car/Chl在NaCl脅迫濃度梯度上呈線性降低趨勢(shì)，表明NaCl脅迫下花椰菜子葉中Chla破壞程度大于Chlb，且 Car含量大幅度下降，降低了幼苗抵抗氧化脅迫的能力，增強(qiáng)了活性氧脅迫對(duì)葉綠體膜的傷害，從而導(dǎo)致其幼苗的光合能力降低。

植物的耐鹽性是一個(gè)受多種因素影響的復(fù)雜數(shù)量性狀；不同的物種對(duì)某一具體指標(biāo)的耐鹽性反應(yīng)不一定相同；單一指標(biāo)難以全面準(zhǔn)確地反映耐鹽性的強(qiáng)弱（江珊 等，2009）。綜合分析發(fā)現(xiàn)，花椰菜種子抗氧化酶（SOD、POD和CAT）活性、相對(duì)鹽害率及Chla、Chlb、Chl和Car含量在 NaCl脅迫濃度梯度上具有明顯的反應(yīng)拐點(diǎn)，說(shuō)明這些指標(biāo)能夠在一定程度上指示 NaCl脅迫對(duì)花椰菜種子活力和抗氧化酶活性及幼苗光合色素傷害的強(qiáng)度水平；這些參數(shù)的變化拐點(diǎn)一般在NaCl脅迫濃度處于102～136 mmol·L-1，表明102～136 mmol·L-1NaCl脅迫下花椰菜種子生理及幼苗光合色素受到顯著影響，可作為花椰菜耐鹽性評(píng)價(jià)的生理生化閾值，以供鹽漬土壤開(kāi)發(fā)利用及耐鹽種質(zhì)評(píng)價(jià)參考。

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