吳憲文，金鵬程，王守志，張 慧，李 輝

（農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，哈爾濱 150030）

試驗(yàn)前期通過(guò)雞腹脂性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）鑒定出多個(gè)與雞腹脂性狀顯著相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)，其中6個(gè)位點(diǎn)分別為rs14483313（命名來(lái)源于60 K SNP芯片，下同）位于Ⅲ型酪氨酸激酶受體（a type III receptor tyrosine kinase,KDR/FlkⅠ/VEGF-2）上；rs13548811位于雞腫瘤候選抑癌基因3（Tumor suppressor candidate 3,TUSC3）上 ；GGaluGA262999位于磷酸核糖焦磷酸轉(zhuǎn)氨酶（Phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase,PPAT）上；GGaluGA263078位于胞外復(fù)合體成分1（Exocyst complex component 1,EXOC1）上；GGaluGA176566位于v-myb鳥(niǎo)類(lèi)成髓細(xì)胞血癥病毒致癌基因同系物2（v-myb myeloblastosis viral oncogene homolog(avian)-like 2,MYBL2）上；rs14482748位于 KIAA 1211上；這些位點(diǎn)的多態(tài)性與肉雞高、低腹脂雙向選擇品系第11世代的腹脂重和腹脂率顯著相關(guān)。

本研究對(duì)6個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在高、低脂肉雞雙向選擇品系第14世代群體和AA隨機(jī)群體中進(jìn)行SNPs檢測(cè)和關(guān)聯(lián)分析，旨在研究這6個(gè)基因的多態(tài)位點(diǎn)與雞生長(zhǎng)和體組成性狀的相關(guān)性，從而為后續(xù)開(kāi)展相關(guān)基因的功能研究和尋找可用于肉雞育種的分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 雞群和性狀的測(cè)定

以東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院選育的高、低脂肉雞雙向選擇品系第14世代群體（NEAUHLFG14）612個(gè)體（高脂系320個(gè)體，低脂系292個(gè)體）和AA肉雞商業(yè)隨機(jī)群體386個(gè)體為試驗(yàn)材料。試驗(yàn)雞群按常規(guī)方法進(jìn)行飼養(yǎng)管理，7周齡時(shí)翅靜脈采血，EDTA-Na2抗凝，酚∶氯仿抽提DNA之后，TE溶解，-20℃保存。測(cè)定1、3、5、7周齡體重（Body weight,BW）、屠體重（Carcass weight,CW）、腹脂重（Abdominal fat weight,AFW）、腹脂率（Abdominal fat percent,AFP）（腹脂重/體重）、肝臟重（Liver weight,LW）、心臟重（Heart weight,HW）、脾臟重（Spleen weight，SpW）、睪丸重（Testicle weight,TeW）、極低密度脂蛋白濃度（Very low density lipoproteins,VLDL）。

1.2 引物設(shè)計(jì)

結(jié)果見(jiàn)圖1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室雞腹脂性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析提供的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)據(jù)和雞基因組測(cè)序結(jié)果（www.genome.ucsc.edu），使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)6對(duì)引物用于多態(tài)性檢測(cè)，引物由北京英駿生物公司合成，如表1所示。

1.3 基因分型

根據(jù)六個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，采用PCR-RFLP方法對(duì)高、低脂肉雞雙向選擇品系第14世代群體和AA肉雞商業(yè)隨機(jī)群體個(gè)體進(jìn)行基因型分析。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：50 ng·μg-1基因組DNA 1 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、10 mmol·L-1dNTP 2 μL、10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL、5 U·μL-1TaqDNA聚合酶0.25 μL、去離子水18.25 μL。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性條件均為94℃，5 min；變性條件均為94℃，30 s；延伸條件均為72℃，20 s；終極延伸條件均為72℃，5 min。退火條件、循環(huán)數(shù)及酶切條件如表2所示。內(nèi)切酶由NEB公司提供，酶切反應(yīng)體系（20 μL），按照使用說(shuō)明進(jìn)行配置。

表2 各位點(diǎn)PCR及酶切條件Table 2 Conditions of PCR，PCR-RFLP

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)高、低肉雞腹脂雙向選擇品系群體的特點(diǎn)，構(gòu)建基因型效應(yīng)統(tǒng)計(jì)模型①，根據(jù)AA肉雞商業(yè)隨機(jī)群體的特點(diǎn)，構(gòu)建基因型效應(yīng)統(tǒng)計(jì)模型②：

其中Y為性狀觀測(cè)值，μ為群體均值，G為基因型固定效應(yīng)，L為品系固定效應(yīng)，G*L為基因型和品系互作效應(yīng)，F(xiàn)（L）為品系內(nèi)的家系效應(yīng)，D（F,L）為家系內(nèi)與品系內(nèi)母雞的隨機(jī)效應(yīng)，S為性別固定效應(yīng)，G*S為基因型和性別互作效應(yīng)，F(xiàn)為家系的隨機(jī)效應(yīng)，D（F）為家系內(nèi)母雞的隨機(jī)效應(yīng)，BW7為7周齡體重做為屠體組成性狀的校正因子，e為剩余值效應(yīng)。

運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件JMP4.0（SAS公司,2000）進(jìn)行相關(guān)分析；采用SAS9.1.3軟件對(duì)高、低肉雞腹脂雙向選擇品系間基因型頻率和等位基因頻率差異進(jìn)行χ2獨(dú)立性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-RFLP檢測(cè)

結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 PCR-RFLP基因分型Fig.1 PCR-RFLP patterns

針對(duì)以上六個(gè)位點(diǎn)用相應(yīng)的引物對(duì)高、低肉雞腹脂雙向選擇第14世代群體和AA肉雞商業(yè)隨機(jī)群體基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段與目的片段大小一致且特異性較好。采用RFLP的方法進(jìn)行個(gè)體基因型分析。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)酶切后均產(chǎn)生3種基因型，分型及命名見(jiàn)圖1。圖1中A-E分別對(duì)應(yīng)為SNP1-6的基因分型圖片。

2.2 群體遺傳學(xué)分析

對(duì)六個(gè)突變位點(diǎn)在NEAUHLF第14世代中進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，檢驗(yàn)結(jié)果表明基因型頻率、等位基因頻率分布在高、低腹脂雙向選擇品系間均存在極顯著差異（P＜0.01）。SNP1和SNP3位點(diǎn)TT基因型和T等位基因在低脂系中的頻率極顯著高于在高脂系中的頻率，CC基因型和C等位基因在高脂系中的頻率極顯著高于在低脂系中的頻率。SNP2、SNP4和SNP5位點(diǎn)TT基因型和T等位基因在高脂系中的頻率極顯著高于在低脂系中的頻率，CC基因型和C等位基因在低脂系中的頻率極顯著高于在高脂系中的頻率。SNP6位點(diǎn)AA基因型和A等位基因在高脂系中的頻率極顯著高于在低脂系中的頻率，GG基因型和G等位基因在低脂系中的頻率極顯著高于在高脂系中的頻率，如表3所示。

表3 六個(gè)位點(diǎn)不同基因型、等位基因頻率在高、低脂系兩系間的分析Table 3 Comparisons of frequencies of genotype and allele in two lines of chicken divergently selected for abdominal fat content

2.3 6個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性與雞生長(zhǎng)和體組成性狀的相關(guān)分析

在高、低肉雞腹脂雙向選擇品系第14世代群體和AA肉雞商業(yè)隨機(jī)群體中進(jìn)行基因型與生長(zhǎng)和體組成性狀的相關(guān)分析，各位點(diǎn)對(duì)性狀的影響（P值）見(jiàn)表4，基因型效應(yīng)間的多重比較結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明SNP1位點(diǎn)的多態(tài)性對(duì)NEAUHLFG14的AFW、AFP、CW和LW 有顯著影響（P＜0.05），并且這四種性狀的CC和CT基因型個(gè)體最小二乘均值（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為均值）均顯著高于TT基因型個(gè)體（P＜0.05）。

SNP2位點(diǎn)的多態(tài)性對(duì)NEAUHLFG14的BW7、HW和VLDL有顯著影響（P＜0.05），BW7和VLDL的CC和TC基因型個(gè)體均值顯著高于TT型個(gè)體（P＜0.05），HW的TT和TC型個(gè)體均值顯著高于TT型個(gè)體（P＜0.05）；該位點(diǎn)的多態(tài)性對(duì)AA群體的SpW有顯著影響（P＜0.05），且CC型個(gè)體均值顯著高于TC和TT型個(gè)體（P＜0.05）。

表4 六個(gè)多態(tài)位點(diǎn)對(duì)高、低脂雙向選擇品系14世代和AA肉雞商業(yè)隨機(jī)群體生長(zhǎng)和體組成性狀的影響Table 4 Effects of six polymorphism on growth and body composition traits in NEAUHLFG14 and Arbor Acres（AA）commercial random population

表5 高、低脂雙向選擇品系第14世代中各位點(diǎn)基因型間多重比較Table 5 Multiple comparisons among least-squares means with different genotypes in NEAUHLFG14

SNP3位點(diǎn)的多態(tài)性對(duì)NEAUHLFG14的VLDL有顯著影響（P＜0.05），且TT型個(gè)體均值顯著高于TC和CC型個(gè)體（P＜0.05）；該位點(diǎn)的多態(tài)性對(duì)AA群體的LW有顯著影響（P＜0.05），且TC型個(gè)體均值顯著高于TT型個(gè)體（P＜0.05）。

SNP4位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)NEAUHLFG14的BW7、CW、HW和VLDL有顯著影響（P＜0.05），CC型個(gè)體的VLDL和HW顯著高于TC和TT型個(gè)體（P＜0.05），CC和TC基因型個(gè)體的BW7顯著高于TT型個(gè)體（P＜0.05），CC型個(gè)體的CW顯著高于TT型個(gè)體（P＜0.05）；該位點(diǎn)的多態(tài)性對(duì)AA群體的BW7和SpW有顯著影響（P＜0.05），且TT型個(gè)體的BW7顯著高于TC和CC型個(gè)體（P＜0.05），CC型個(gè)體的SpW顯著高于TT型個(gè)體（P＜0.05）。

SNP5位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)NEAUHLFG14的SpW有顯著影響（P＜0.05），且CC型個(gè)體均值顯著高于TC和TT型個(gè)體（P＜0.05）；該位點(diǎn)的多態(tài)性對(duì)AA群體的BW3有顯著影響（P＜0.05），TT型個(gè)體均值顯著高于CC型個(gè)體（P＜0.05）。

SNP6位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)NEAUHLFG14的VLDL有顯著影響（P＜0.05），且GG型個(gè)體均值顯著高于AA和AG型個(gè)體（P＜0.05）；該位點(diǎn)的多態(tài)性對(duì)AA群體的BW1和LW有顯著影響（P＜0.05），且AA個(gè)體BW1顯著高于AG和GG型個(gè)體（P＜0.05），AA和AG型個(gè)體的LW顯著高于GG型個(gè)體（P＜0.05）。

3 討論與結(jié)論

rs14483313突變位于KDR基因上，KDR基因也叫做FlkⅠ、VEGF-2，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子2（Vascular endothelial growth factor-2,VEGF-2）是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族成員[1]，它與血管的生成及造血功能有關(guān)[2]。有研究表明血管生成與脂肪生成在時(shí)間和空間上有很大的聯(lián)系。在時(shí)間上關(guān)于脂肪組織發(fā)育研究指出，胚胎期血管的生成早于脂肪的生成[3]。在空間上新的血管生成總是伴隨著脂肪細(xì)胞的分化，在這個(gè)過(guò)程中VEGF是關(guān)鍵因子[4]。肥胖與骨骼肌毛細(xì)血管密度降低有關(guān)[5]，抑制血管生成可以減少脂肪聚集[6-9]。可以看出血管生成與脂肪生成之間存在密切關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，rs14483313（SNP1）突變對(duì)AA肉雞商業(yè)隨機(jī)群體腹脂性狀的影響未達(dá)到顯著水平。但對(duì)高、低脂肉雞雙向選擇品系第14世代AFW和AFP都有顯著影響（P＜0.05），這與前期GWAS在高、低脂肉雞雙向選擇品系第11世代所得結(jié)果一致。該位點(diǎn)在NEAUHLFG14的低脂系中所有個(gè)體均為T(mén)T基因型，推測(cè)T等位基因有可能經(jīng)過(guò)前幾個(gè)世代的選擇已固定。從基因型效應(yīng)來(lái)看，TT基因型個(gè)體AFW、AFP顯著低于CC型個(gè)體（P＜0.01），所以，T等位基因是降低雞腹脂沉積的等位基因，在育種中可以嘗試選擇TT基因型個(gè)體培育低脂肉雞品系。

研究發(fā)現(xiàn)，rs13548811（SNP2）突變對(duì)高、低脂肉雞雙向選擇品系第14世代群體后期體重性狀有影響，從3～7周齡逐漸增大，到3、5周齡時(shí)已接近顯著（P值分別為0.0736，0.0637，表4中未給出），7周齡時(shí)達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。CC型個(gè)體的7周齡體重顯著高于TT型個(gè)體（P＜0.05），CC基因型和C等位基因在低脂系中的頻率顯著高于在高脂系中的頻率，以此推斷CC基因型為高、低脂系中體重性狀的有利基因型，可以嘗試在育種中通過(guò)選擇此基因型個(gè)體提高雞的體重性狀。

GGaluGA263078（SNP4）突變對(duì)雞7周齡體重有顯著影響，尤其在NEAUHLFG14和AA群體遺傳背景不同的群體中該位點(diǎn)對(duì)BW7的影響一致（P＜0.05），因此推測(cè)該位點(diǎn)很可能是影響雞體重性狀的致因突變位點(diǎn)，或與致因突變位點(diǎn)緊密連鎖。

本文所研究的6個(gè)突變位點(diǎn)在高、低脂肉雞雙向選擇品系第11世代中都與腹脂性狀顯著相關(guān)，但在NEAUHLFG14和AA群體中卻無(wú)一致結(jié)果。群體的遺傳背景不同是造成群體間相關(guān)分析不一致的重要原因之一。高、低脂雙向選擇品系是一個(gè)對(duì)腹脂性狀經(jīng)過(guò)多世代選擇的群體，隨著從第11世代到第14世代的選擇，該群體基因組位點(diǎn)間連鎖不平衡程度發(fā)生了變化；與高、低脂雙向選擇品系群體相比，AA隨機(jī)群體未經(jīng)過(guò)特定性狀選擇群體，其遺傳背景（基因的等位基因頻率、基因位點(diǎn)連鎖不平衡程度等）不同的。這時(shí)突變位點(diǎn)與影響雞腹脂性狀的致因突變緊密連鎖。

在這6個(gè)突變位點(diǎn)中有4個(gè)（SNP2、SNP3、SNP4和SNP6）都與NEAUHLFG14的VLDL濃度顯著相關(guān)（P＜0.05）。有研究表明，VLDL濃度是間接度量雞體肥度的最好指標(biāo)，血漿VLDL濃度與腹脂重和腹脂率呈顯著的正表型相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.4168和0.3576[10]，對(duì)血漿VLDL濃度的低向選擇會(huì)使腹脂沉積減少[11]。結(jié)果表明，這些基因可能對(duì)雞的腹部脂肪組織生長(zhǎng)和發(fā)育發(fā)揮重要作用。

綜上所述，這六個(gè)基因可能是影響雞腹脂性狀的重要基因，但本研究中的多態(tài)位點(diǎn)是否為功能性位點(diǎn)需進(jìn)一步驗(yàn)證。

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