鄭 鵬，于 磊，田亞光，黃 賀，張貴學(xué)

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

雄性生殖干細(xì)胞具有自我復(fù)制和分化成精子的能力，是動(dòng)物體內(nèi)唯一能進(jìn)行遺傳信息傳遞的干細(xì)胞。雄性生殖干細(xì)胞既是干細(xì)胞生物學(xué)的重要研究對(duì)象，又是研究精子發(fā)生、制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和研究基因功能的重要資源。Brinter等報(bào)道，將可育小鼠的雄性生殖干細(xì)胞移植到不育小鼠的睪丸中并建立精子發(fā)生[1]，雄性生殖干細(xì)胞成為干細(xì)胞研究領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。然而，雄性生殖干細(xì)胞的體外長(zhǎng)期培養(yǎng)卻未獲得成功。直到Kanatsu-Shinohar等和Kubota等先后報(bào)道了小鼠的雄性生殖干細(xì)胞的體外長(zhǎng)期培養(yǎng)和增殖的成熟體系[2]。生殖干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，將為克隆動(dòng)物[2]、保護(hù)瀕危物種[3]、生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物[4]、治療雄性不育以及一些人類遺傳疾病的基因治療[5]提供新的機(jī)遇與途徑。最近的研究表明，雄性生殖干細(xì)胞可以誘導(dǎo)分化成特定類型的細(xì)胞[6-8]，在再生醫(yī)學(xué)治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，是繼ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞之后的另一種細(xì)胞來源。在牛ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞沒有成功建立之前，進(jìn)行牛雄性生殖干細(xì)胞體外培養(yǎng)，研究牛雄性生殖干細(xì)胞的多能性，闡述細(xì)胞重編程的重要基礎(chǔ)理論具有重要意義。

目前，關(guān)于哺乳動(dòng)物雄性生殖干細(xì)胞體外增殖與分化研究主要集中在小鼠和人，其他動(dòng)物的研究很少。有關(guān)牛雄性生殖干細(xì)胞的研究主要是集中在對(duì)4～6月齡牛雄性生殖干細(xì)胞的分離純化[9-11]、冷凍保存[12]、自體移植[13]、異體移植[14]、體外分化培養(yǎng)[15]等。本文對(duì)新生牛雄性生殖干細(xì)胞進(jìn)行分離純化，對(duì)其培養(yǎng)、鑒定，探討新生牛睪丸雄性生殖干細(xì)胞體外增殖相關(guān)影響因素和技術(shù)體系，以期為建立穩(wěn)定、高效的家畜雄性生殖干細(xì)胞體外增殖與分化體系提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與藥品

新生牛睪丸采自出生后未超過24 h健康的荷斯坦公牛（哈爾濱市現(xiàn)代生物科技有限公司提供）。無菌操作取出雙側(cè)睪丸，置于4℃生理鹽水中，2 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室。

實(shí)驗(yàn)所用試劑除DMEM/F-12、FBS(購自Gibco公司)外，其他無特殊說明外（均購自Sigma公司）；實(shí)驗(yàn)所用抗體（購自Santa cruz公司）；RNA提取試劑盒（購自Solarbio）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自ABI）；Taq酶等（均購自大連寶生物公司）；雄性生殖干細(xì)胞培養(yǎng)基：DMEM/F-12+2%（或10%）血清+2 mmol·L-1-谷氨酰胺+0.1 mmol·L-1巰基乙醇+1%雙抗+1%MEM非必需氨基酸溶液+1%MEM維生素溶液+10 μg·mL-1胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉+30 μg·mL-1丙酮酸鈉。

1.2 方法

1.2.1 生殖干細(xì)胞的分離純化

參照文獻(xiàn)[16]的方法制備生精細(xì)胞懸液，并采用差速貼壁法和不連續(xù)密度梯度Percoll分選法分離純化生殖干細(xì)胞和支持細(xì)胞。

差速貼壁分選采用6種方法：分別是含10%血清的培養(yǎng)液、培養(yǎng)2～4 h后差速、過夜培養(yǎng)、進(jìn)行兩步法差速（A）；含2%血清的培養(yǎng)液、培養(yǎng)2～4 h后差速、過夜培養(yǎng)、進(jìn)行兩步法差速（B）；含2%血清的培養(yǎng)液、直接培養(yǎng)過夜、進(jìn)行一步法差速（C）；用明膠包被培養(yǎng)瓶，按照上述三種方法（A、B、C）進(jìn)行差速（A+、B+、C+）。分別在差速前（0 h）、培養(yǎng)2～4 h后差速后、過夜培養(yǎng)差速后進(jìn)行AKP染色，鑒定生殖干細(xì)胞的比例。

參照文獻(xiàn)[17-18]的方法進(jìn)行生精細(xì)胞的不連續(xù)密度梯度Percoll分選，Percoll分選法分別采用20%、30%、40%、50%、60%的Percoll液進(jìn)行分選。分選的各層細(xì)胞分別用臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行死活染色、AKP進(jìn)行生殖干細(xì)胞的比例鑒定。

生精細(xì)胞懸液進(jìn)行不連續(xù)密度梯度Percoll分選后，采用A種方法，進(jìn)行兩次差速貼壁分選。分選后用進(jìn)行AKP染色，鑒定生殖干細(xì)胞的比例。

1.2.2 生殖干細(xì)胞的培養(yǎng)

將純化的雄性生殖干細(xì)胞以1×104個(gè)·cm-2的密度接種于35 mm培養(yǎng)皿中（Coing），于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液分別為含2%和10%濃度血清的培養(yǎng)液，檢測(cè)血清濃度對(duì)生殖干細(xì)胞和支持細(xì)胞增殖的影響。在2%血清濃度的培養(yǎng)液中添加100 ng的GDNF培養(yǎng)雄性生殖干細(xì)胞，觀察生殖干細(xì)胞的增殖并進(jìn)行AKP和OCT-4免疫組化染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 差速貼壁分選的比較

差速貼壁分選的結(jié)果見表1，明膠包被培養(yǎng)瓶的方法，并沒有顯著提高生殖干細(xì)胞的比例（P＞0.05）；培養(yǎng)2～4 h后差速，10%的血清培養(yǎng)液組的細(xì)胞AKP陽性率顯著高于2%的血清培養(yǎng)液組（P＜0.05）；過夜培養(yǎng)后，六種方法之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 不連續(xù)密度梯度分選

生殖干細(xì)胞懸液梯度分選后，形成兩條帶和最底層的血細(xì)胞。第一條帶的細(xì)胞離心洗滌后，利用臺(tái)盼藍(lán)染色，顯示大部分是死細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞沒有貼壁。第二條帶的細(xì)胞離心洗滌后，利用臺(tái)盼藍(lán)染色，顯示95%以上都是活細(xì)胞，利用AKP進(jìn)行染色，顯示雄性生殖干細(xì)胞的比例在7%左右（見表2）。

2.3 差速貼壁分選與不連續(xù)密度梯度分選的比較

梯度分選后，繼續(xù)進(jìn)行兩次差速貼壁，并與單純的差速貼壁、梯度分選進(jìn)行比較，結(jié)果顯示（見表2），不連續(xù)密度梯度分選能有效的去除細(xì)胞碎屑和血細(xì)胞，但同時(shí)也會(huì)損失一些雄性生殖干細(xì)胞和支持細(xì)胞（回收細(xì)胞數(shù)6.1×106＜細(xì)胞總數(shù)107），回收的雄性生殖干細(xì)胞數(shù)與不連續(xù)密度梯度后進(jìn)行差速貼壁分選之間差異不顯著。差速貼壁分選的回收細(xì)胞數(shù)、回收的雄性生殖干細(xì)胞數(shù)顯著高于不連續(xù)密度梯度后進(jìn)行差速貼壁分選，二者的細(xì)胞AKP陽性率之間差異不顯著。三種方法的細(xì)胞活率之間差異不顯著?？梢?，不連續(xù)密度梯度分選的作用主要在于除去血細(xì)胞和細(xì)胞碎屑的影響。

表1 雄性生殖干細(xì)胞差速貼壁分選比較（AKP陽性率,%）（n=10）Table 1 Comparison of differential adhesion methods of male germline stem cells(AKP positive rates,%,n=10)

表2 差速貼壁與梯度分選的比較（n=10）Table 2 Comparison of differential adhesion and gradient sorting method

2.4 不同培養(yǎng)液的比較

2.4.1 血清對(duì)雄性生殖干細(xì)胞增殖的影響

將分離純化后的雄性生殖干細(xì)胞懸液以1×104個(gè)·mL-1的密度接種到培養(yǎng)板內(nèi)，檢測(cè)血清濃度對(duì)細(xì)胞增殖的影響。雄性生殖干細(xì)胞進(jìn)行緩慢的增殖，并且在培養(yǎng)的0～7 d內(nèi)，10%培養(yǎng)液中的增殖速度稍大于2%培養(yǎng)液中的增殖速度，但差異并不顯著（P＞0.05），在培養(yǎng)10 d時(shí)，10%培養(yǎng)液中雄性生殖干細(xì)胞數(shù)量小于2%培養(yǎng)液中雄性生殖干細(xì)胞數(shù)量，差異也不顯著（P＞0.05）（見表3）。

表3 血清對(duì)雄性生殖干細(xì)胞增殖的影響（×104）（n=5）Table 3 Impact of serum to male germline stem cells proliferation(×104,n=5)

2.4.2 血清對(duì)支持細(xì)胞增殖的影響

支持細(xì)胞增殖速度較快，并且在培養(yǎng)的7～10d時(shí)，10%培養(yǎng)液中增殖速度大于2%培養(yǎng)液中的增殖速度，且二者之間差異顯著（P＜0.05）（見表4）。

表4 血清對(duì)支持細(xì)胞增殖的影響（×104,n=5）Table 4 Impact of serum to sertoli cells proliferation （×104,n=5）

在2%和10%血清濃度的培養(yǎng)液中雄性生殖干細(xì)胞增殖速度相近，而10%血清濃度的培養(yǎng)液中支持細(xì)胞增殖較快（見圖1），由于競(jìng)爭(zhēng)營養(yǎng)和生長(zhǎng)空間，不利于雄性生殖干細(xì)胞增殖。因此，本試驗(yàn)在原代培養(yǎng)時(shí)，使用2%血清濃度的培養(yǎng)液。

圖1 血清濃度對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Impact of different serum concentrations to cell proliferation

2.5 雄性生殖干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

將分離純化后的雄性生殖干細(xì)胞懸液以1×104個(gè)·mL-1的密度接種到培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，添加100 ng的GDNF能顯著促進(jìn)雄性生殖干細(xì)胞增殖（見表5）。增殖的雄性生殖干細(xì)胞集落進(jìn)行AKP、OCT-4染色，集落呈陽性表達(dá)結(jié)果見圖版Ⅰ、Ⅱ（圖版Ⅱ彩版見封二），初步確定雄性生殖干細(xì)胞集落具有一定的多能性。

表5 GDNF對(duì)雄性生殖干細(xì)胞增殖的影響（×104,n=5）Table 5 Impact of GDNF to male germline stem cells proliferation （×104,n=5）

圖版Ⅰ 培養(yǎng)3 d的雄性生殖干細(xì)胞的AKP染色PlateⅠ AKP staining of male germline stem cells after 3 d cultured,Bar=100 μm

圖版Ⅱ 雄性生殖干細(xì)胞的OCT-4染色PlateⅡ OCT-4 staining of male germline stem cells

3 討論與結(jié)論

3.1 生殖干細(xì)胞的分離與純化

生精上皮細(xì)胞的分離多采用膠原酶、透明質(zhì)酸酶、胰酶、DNA酶組合法消化，不同的實(shí)驗(yàn)室根據(jù)需要采用不同的組合。其關(guān)鍵在于控制消化程度，若消化不足，則管周肌樣細(xì)胞殘余較多；消化過度，則生精上皮細(xì)胞大量丟失或受損，嚴(yán)重影響細(xì)胞產(chǎn)量及活率。本試驗(yàn)先采用膠原酶處理，獲得較純凈的曲細(xì)精管，然后以胰酶消化曲細(xì)精管獲得生精上皮細(xì)胞。生精細(xì)胞懸液中常常并不能完全徹底地分離出目的細(xì)胞，只能達(dá)到培養(yǎng)物中以某種細(xì)胞為主的程度，所以也常稱為富集（Enrichment）。分離純化的方法主要有：不連續(xù)Percoll密度梯度離心法[17-18]、差速貼壁分選法[19]、流式細(xì)胞分選法[19-20]以及免疫磁珠分離法[6,20]等。本試驗(yàn)應(yīng)用差速貼壁法、不連續(xù)密度梯度Percoll分選法分選生殖干細(xì)胞和支持細(xì)胞，結(jié)果顯示不連續(xù)密度梯度分選能有效的去除細(xì)胞碎屑和血細(xì)胞，同時(shí)也會(huì)損失一些雄性生殖干細(xì)胞和支持細(xì)胞，綜合考慮，差速貼壁分選法與其他方法相比更加簡(jiǎn)單、可行。

3.2 生殖干細(xì)胞的培養(yǎng)與多能性

目前，精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基種類較多，添加成分各異，一般采用DMEM/F-12為基本培養(yǎng)基。Izadyar等研究認(rèn)為牛精原細(xì)胞在MEM中培養(yǎng)比在KSOM中培養(yǎng)增殖更快[10]。Kubota等比較α-MEM和F12對(duì)小鼠精原細(xì)胞體外無血清培養(yǎng)的效果，結(jié)果表明α-MEM效果較好，顯示不同動(dòng)物來源的精原細(xì)胞需要采用不同的培養(yǎng)系統(tǒng)[20]。

當(dāng)前關(guān)于精原干細(xì)胞培養(yǎng)條件的相關(guān)報(bào)道中絕大多數(shù)都添加一定量的血清。有研究表明，培養(yǎng)不同動(dòng)物精原干細(xì)胞，培養(yǎng)基中所添加的血清濃度是不同的，對(duì)于牛精原細(xì)胞在無血清的條件下，培養(yǎng)幾天后精原細(xì)胞大量死亡；加入2.5%血清時(shí)，精原細(xì)胞的存活和增殖情況有明顯改善；加入更高濃度血清時(shí)，雖然精原細(xì)胞數(shù)目增加，但支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的增殖遠(yuǎn)大于精原細(xì)胞[10]。因此，適宜的血清濃度可以延長(zhǎng)精原細(xì)胞體外存活時(shí)間。膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子（Glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β超家族的一個(gè)成員。體外試驗(yàn)研究顯示，培養(yǎng)液中添加GDNF影響多種動(dòng)物精原干細(xì)胞的增殖，Shinohara等[19]試圖建立小鼠精原細(xì)胞的無血清或無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系，但結(jié)果顯示在無飼養(yǎng)層和GDNF存在時(shí)，精原細(xì)胞不能增殖。大多數(shù)關(guān)于精原干細(xì)胞培養(yǎng)的報(bào)道均表明，GDNF是調(diào)節(jié)精原干細(xì)胞增殖、分裂的關(guān)鍵因素之一[15]。在本試驗(yàn)中，采用2%血清，添加GDNF的培養(yǎng)液培養(yǎng)生殖干細(xì)胞，能顯著促進(jìn)雄性生殖干細(xì)胞增殖。

AKP（Alkaline phosphatase）在胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞中的活性很高，干細(xì)胞一旦分化，則AKP呈陰性。AKP常用來作為鑒定干細(xì)胞特性的標(biāo)志[21]。OCT-4是POU家族的轉(zhuǎn)錄因子，由pou5f1基因編碼，在早期胚胎發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，所表達(dá)的蛋白質(zhì)是細(xì)胞全能性的重要標(biāo)志，OCT-4是參與調(diào)控胚胎干細(xì)胞自我更新和維持其全能性最為重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，同時(shí)也是體外建立誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）的關(guān)鍵基因[22]。OCT-4在ESC、PGCs、精原干細(xì)胞中都存在表達(dá)[23]，并且用來鑒定細(xì)胞是處于自我更新、維持未分化的多能性狀態(tài)，還是進(jìn)入分化狀態(tài)、失去多能性。因此，試驗(yàn)中應(yīng)用AKP和OCT-4鑒定精原干細(xì)胞，證實(shí)新生牛睪丸中精原干細(xì)胞具有多能性，培養(yǎng)后形成的集落也具有多能性，本研究進(jìn)一步證實(shí)了Simon等關(guān)于精原干細(xì)胞本身就具有多能性，可以直接轉(zhuǎn)化為體細(xì)胞的觀點(diǎn)[8]。

3.3 雄性生殖干細(xì)胞

雄性生殖干細(xì)胞作為體內(nèi)位置確定、終身存在，并且能將攜帶的遺傳信息傳遞至下一代的成體干細(xì)胞，在干細(xì)胞研究中的優(yōu)勢(shì)是顯而易見的：更方便用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究、更方便簡(jiǎn)單地分化成多能干細(xì)胞、為男性不育治療提供新途徑等等。但是，雄性生殖干細(xì)胞的體外增殖和分化一直困擾著生殖干細(xì)胞的發(fā)展進(jìn)步，雖然在嚙齒類動(dòng)物上完成了生殖干細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)鑒定，但是體外生殖干細(xì)胞分化成有活性、有受精能力的可育精子一直沒有突破，大大限制了雄性生殖干細(xì)胞的應(yīng)用和發(fā)展。

本試驗(yàn)對(duì)新生牛雄性生殖干細(xì)胞分離純化的方法進(jìn)行研究，并進(jìn)行培養(yǎng)、鑒定，初步建立了新生牛睪丸雄性生殖干細(xì)胞的分離純化與體外培養(yǎng)技術(shù)體系，將為建立穩(wěn)定、高效的家畜雄性生殖干細(xì)胞體外增殖與分化體系提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

差速壁法能有效分選雄性生殖干細(xì)胞與支持細(xì)胞，2%血清培養(yǎng)液可用于雄性生殖干細(xì)胞體外培養(yǎng)，且培養(yǎng)基中添加GDNF能顯著促進(jìn)雄性生殖干細(xì)胞的增殖，增殖形成的雄性生殖干細(xì)胞集落具有多能性。

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