宋福強(qiáng) 王 健 孔祥仕 常 偉 王倡憲

(黑龍江大學(xué)，哈爾濱，150080)

紫穗槐(Amorpha fruticosa)又稱(chēng)穗花槐，豆科紫穗槐屬，多年生落葉叢生小灌木，東北齊齊哈爾以南栽培［1］。紫穗槐被譽(yù)為是保持水土流失、防風(fēng)固沙的“活鋼筋”，同時(shí)也是解決農(nóng)牧業(yè)肥料、飼料、鄉(xiāng)村開(kāi)展多種經(jīng)營(yíng)、增加收入、改良土壤的優(yōu)良樹(shù)種。

叢枝菌根(arbuscular mycorrhizal fungi，AM)真菌是一種專(zhuān)性?xún)?nèi)共生真菌，可以和自然界中絕大多數(shù)植物形成互惠共生聯(lián)合體［2］，提高植株對(duì)環(huán)境生物和非生物脅迫的耐受力［3］，促進(jìn)植物對(duì)養(yǎng)分的吸收。AM真菌還可以產(chǎn)生生理活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)植物生理代謝活動(dòng)，對(duì)植物的成活、生長(zhǎng)都起到促進(jìn)作用。而紫穗槐根系發(fā)達(dá)，側(cè)根豐富，并且能與AM真菌形成很好的共生關(guān)系［4-6］，因此可作為AM真菌與木本宿主植物之間互惠共生關(guān)系的研究材料。

基因在表達(dá)過(guò)程中由于mRNA的選擇性拼接和修飾即轉(zhuǎn)錄后修飾，以及在翻譯成蛋白質(zhì)的過(guò)程中經(jīng)歷乙酰化、烷基化、糖基化等翻譯后修飾，轉(zhuǎn)錄水平所獲得的基因表達(dá)信息并不足以闡明基因的功能。而蛋白質(zhì)是生物體的基本功能單位，也是基因功能的最終執(zhí)行者，因此，從翻譯水平上研究基因的表達(dá)與功能，是生命科學(xué)發(fā)展的必然趨勢(shì)［7］。近年來(lái)，蛋白組學(xué)在后基因組時(shí)代快速發(fā)展起來(lái)，成為一個(gè)分析生物體或者組織內(nèi)蛋白豐度和蛋白分布的有效工具，用來(lái)分析和鑒定不同組織蛋白表達(dá)特性以及進(jìn)行目標(biāo)蛋白的定位［8］。另一方面，蛋白質(zhì)組學(xué)方法已經(jīng)被用來(lái)研究被AM真菌侵染植物在鹽脅迫下蛋白質(zhì)組變化以及AM真菌—宿主植物共生體系相關(guān)蛋白［9-10］。

為了研究紫穗槐菌根形成過(guò)程中蛋白質(zhì)的變化，從蛋白質(zhì)組水平初步揭示紫穗槐菌根共生體形成的分子機(jī)制，提取紫穗槐菌根總蛋白并建立2-DE體系至關(guān)重要［11］。但目前，有關(guān)紫穗槐菌根蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。雖然國(guó)內(nèi)有很多學(xué)者已建立了其他植物根蛋白質(zhì)組學(xué)的2-DE分離體系［12-14］，但由于不同植物在細(xì)胞結(jié)構(gòu)、根蛋白含量以及色素、酚類(lèi)、醌類(lèi)、多糖等的含量和種類(lèi)均存在差異［15］，目前還沒(méi)有一套體系能夠適用于所有植物。因此，根據(jù)紫穗槐根組織的特點(diǎn)，建立一套紫穗槐2-DE蛋白分離體系，是進(jìn)行紫穗槐根蛋白質(zhì)組學(xué)研究的前提。

蛋白質(zhì)的提取有多種方法，目前常用于植物蛋白組學(xué)研究的根蛋白提取方法是TCA丙酮法及酚提取法［16-17］。本研究對(duì)比TCA丙酮法及酚提取法，優(yōu)化出適于紫穗槐菌根蛋白的提取方法。然后對(duì)2-DE體系的菌根蛋白上樣量以及染色方法進(jìn)行摸索，建立了一套適用于紫穗槐菌根蛋白的雙向電泳體系。以期為揭示紫穗槐菌根形成過(guò)程中特異蛋白的表達(dá)模式以及后續(xù)相關(guān)基因功能的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

供試AM真菌接種體為摩西球囊霉(Glomus mosseae，GM)，孢子含量約為1 630個(gè)/20 g，由黑龍江大學(xué)生態(tài)實(shí)驗(yàn)室保藏;供試植株紫穗槐種子由吉林省林業(yè)科學(xué)研究院提供。

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將紫穗槐種子先用溫水清洗表面，再用0.3%的高錳酸鉀浸泡3～4 h進(jìn)行表面消毒處理，清水洗凈。將處理后的紫穗槐種子放入白瓷盤(pán)中，表面覆蓋濕潤(rùn)白紗布，38℃下催芽，催芽期間適當(dāng)補(bǔ)水保持種子濕潤(rùn)。與此同時(shí)將V(草炭土)∶V(細(xì)沙)∶V(蛭石)=5∶2∶3混合配置栽培基質(zhì)，用牛皮紙包起，121℃、0.1 MPa高壓蒸汽滅菌 2 h，取出自然晾干。將催芽后的紫穗槐種子種植在處理后的土壤中，并對(duì)其做以下處理：(1)非接種植株(CK)，即在滅菌后的基質(zhì)中按每千克加入1 g滅活摩西球囊霉接種體，混合均勻;(2)接種植株(GM)，即在滅菌后的基質(zhì)中按每千克加入1 g摩西球囊霉接種體，混合均勻。接種體由AM真菌的孢子、菌絲、菌根根段組成的根際混合物。

試驗(yàn)在溫室盆栽條件下進(jìn)行，每個(gè)處理重復(fù)15盆，隨機(jī)排列。日間溫度為25～30℃，夜間為18～20℃，相對(duì)濕度為60%～80%，光照16 h/d。每星期澆3次水。第15天開(kāi)始取樣。用Phillip和Hayman的酸性品紅染色方法［18］檢測(cè)菌根侵染情況，取侵染率達(dá)90%的根樣進(jìn)行如下試驗(yàn)。

1.2 紫穗槐菌根蛋白提取

TCA法：將3 g根樣品用液氮研磨成粉末后，加入10 mL10%的TCA丙酮溶液和7μLβ-巰基乙醇，-20℃靜置45 min。20 000 g、4℃離心15 min，去上清留沉淀。向沉淀中加入10 mL丙酮和7μLβ-巰基乙醇，靜置1 h。20 000 g，4℃離心15 min，去上清留沉淀。沉淀用10 mL丙酮和7μLβ-巰基乙醇清洗至上清無(wú)色。將沉淀真空干燥，所得干粉-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

酚提取法：將3 g根樣品用液氮研磨成粉末后，加入 10 mL 蛋白提取液(0.02 mol/L Tris、0.25 mol/L 蔗糖、0.01 mol/L EDTA、0.01 mol/L PMSF、0.01 mol/L DTT、1%TritionX-100)，研磨 15 min。再加入等體積Tris-飽和酚，繼續(xù)研磨5 min。然后20 000 g、4℃離心15 min，收集酚相于新的離心管中，向新管加入5倍體積0.1 mol/L的乙酸銨甲醇溶液，-20℃過(guò)夜。20 000 g、4℃離心15 min，去上清。最后用含0.07% β-巰基乙醇的丙酮洗滌至上清無(wú)色。將沉淀真空干燥，所得干粉置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 紫穗槐根總蛋白定量

使用GE公司的2D-Quant試劑盒(美國(guó))對(duì)提取的總蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析。

1.4 蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳初步檢測(cè)菌根共生相關(guān)蛋白

采用SDS-PAGE不連續(xù)系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)組分分析，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。將40μL蛋白樣品與10μL 5×Loading Buffer混勻后沸水浴5 min。取10μL上樣，電泳條件為：濃縮膠80 V;分離膠120 V。使用考馬斯亮藍(lán)R-350染色，熱染10 min。染色結(jié)束后用脫色液脫色至背景清晰為止。

1.5 雙向電泳分離紫穗槐菌根蛋白

試驗(yàn)采用800μg和1 000μg兩種蛋白上樣量進(jìn)行雙向電泳。用水化液將蛋白質(zhì)樣品溶液定容至450μL，加入到上樣槽中。然后選用pH值4～7的24 cm IPG預(yù)制干膠條，進(jìn)行第一向等電聚焦。第一向等電聚焦結(jié)束后，將膠條平衡，放到第二向玻璃板中。加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液，室溫靜置15 min后開(kāi)始第二向電泳。電泳參數(shù)設(shè)定為：2 w/膠、電泳45 min;15 w/膠、電泳5～6 h;冷循環(huán)設(shè)定溫度為16℃。凝膠采用考馬斯亮藍(lán)R-250和考馬斯亮藍(lán)R-350染色。

1.6 凝膠圖譜掃描和分析

對(duì)脫色結(jié)束的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行掃描，分辨率為300 dp。用Gel-Pro analyzer軟件進(jìn)行 SDSPAGE膠條帶分析，Image Master TM 2D Platinum(Version 7.0)進(jìn)行雙向電泳圖譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙向電泳體系的建立

SDS-PAGE優(yōu)化蛋白質(zhì)提取：紫穗槐為多年生落葉叢生小灌木，其遺傳特性和生物學(xué)特性都要比草本復(fù)雜，而且根部木質(zhì)化較重，導(dǎo)致其根蛋白含量較葉片等部位低。常規(guī)的提取方法獲得的蛋白含量低，導(dǎo)致很多低豐度蛋白無(wú)法分離及分析，對(duì)后續(xù)的試驗(yàn)研究造成很大的影響。試驗(yàn)運(yùn)用SDS-PAGE電泳對(duì)TCA法和酚提取法對(duì)菌根侵染率達(dá)到90%以上的紫穗槐菌根蛋白提取、比較，結(jié)果如圖1所示。

圖1 SDS-PAGE電泳圖

通過(guò)Gel-Pro analyzer軟件對(duì)電泳圖譜進(jìn)行分析，結(jié)果表明A、B兩泳道未檢測(cè)到有效的條帶，C泳道檢測(cè)條帶數(shù)為24條，D泳道檢測(cè)條帶數(shù)為25條。可見(jiàn)，酚提取法與TCA丙酮法具有顯著的差異，蛋白條帶數(shù)目明顯多于TCA丙酮法。

將C與D泳道進(jìn)行比較分析，其中出現(xiàn)3條表達(dá)量呈上升趨勢(shì)的蛋白條帶，圖中標(biāo)示為3、4、5，分子量分別為 78.2、65.7、33.6 KDa;1 條表達(dá)量呈下降趨勢(shì)的蛋白條帶，分子量分別為27.0 KDa;2條特異蛋白條帶，圖中標(biāo)示為2、6，分子量分別為15.7、21.3 KDa。從SDS-PAGE差異條帶可初步看出AM真菌與宿主植物共生后引起蛋白表達(dá)的變化。

蛋白質(zhì)定量結(jié)果：通過(guò)GE公司2D-Quant試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，獲得蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖2所示。

圖2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖，計(jì)算酚提取法蛋白樣品質(zhì)量濃度。接種滅活A(yù)M真菌處理組的蛋白質(zhì)量濃度為21.62 g/L;接種摩西球囊霉處理組的蛋白濃度為26.49 g/L。蛋白濃度完全滿(mǎn)足雙向電泳24 cm膠條對(duì)蛋白質(zhì)樣品的要求。

染色方法比較：蛋白質(zhì)雙向電泳染色方法主要分為兩種：銀染和考馬斯亮藍(lán)染色。銀染靈敏度高，要求蛋白上樣量少，但大多數(shù)銀染方法與質(zhì)譜不兼容［19］，常作為分析膠的染色方法。考馬斯亮藍(lán)染色較銀染方法靈敏度低，要求較高的上樣量，但考馬斯亮藍(lán)染色方法與質(zhì)譜兼容性強(qiáng)，主要用于制備膠染色，便于做蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定。試驗(yàn)?zāi)z選用考馬斯亮藍(lán)R-250、R-350兩種染色方法分析。電泳條件為：上樣量1 000μg;第一向采用pH值4～7線(xiàn)性24 cm IPG膠條，第二向SDS-PAGE凝膠濃度為12%，結(jié)果如圖3所示。

圖3 紫穗槐根蛋白不同染色方法比較2-DE圖

經(jīng) Image Master TM 2D Platinum(Version 7.0)對(duì)兩塊凝膠分析，考馬斯亮藍(lán)R-250染色獲得426個(gè)蛋白斑點(diǎn)，考馬斯亮藍(lán)R-350染色獲得442個(gè)蛋白斑點(diǎn)。同時(shí)，考馬斯亮藍(lán)R-350染色后的凝膠膠塊背景較淺，蛋白質(zhì)點(diǎn)之間邊界清晰。而且考馬斯亮藍(lán)R-350較考馬斯亮藍(lán)R-250染色還具有時(shí)間短，操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。

綜上所述，將考馬斯亮藍(lán)R-350染色方法作為2-DE體系的首選染色方法。

不同上樣量比較：過(guò)高的上樣量會(huì)造成很多高豐度蛋白掩蓋低豐度蛋白，從而丟失低豐度蛋白信息。而上樣量過(guò)低會(huì)使很多低豐度蛋白無(wú)法在凝膠圖譜中顯示出來(lái)，同樣會(huì)丟失低豐度蛋白信息，但低豐度蛋白往往是生命活動(dòng)中起重要作用的功能蛋白［20］，同時(shí)也最有可能是在菌根共生的信號(hào)傳導(dǎo)中起關(guān)鍵性作用的信號(hào)因子。故選擇合適的上樣量對(duì)獲得分辨率高的凝膠圖譜至關(guān)重要。試驗(yàn)選擇800 μg和1 000μg兩種上樣量，第一向采用pH值4～7線(xiàn)性24 cm IPG膠條，第二向SDS-PAGE凝膠濃度為12%，考馬斯亮藍(lán)R-350染色，結(jié)果如圖4所示。

圖4 紫穗槐根蛋白不同上樣量比較2-DE圖

經(jīng)3次平行實(shí)驗(yàn)，獲得重復(fù)性好的圖譜。上樣量1 000μg時(shí)檢測(cè)到的蛋白斑點(diǎn)數(shù)目與上樣量800 μg時(shí)檢測(cè)到蛋白斑點(diǎn)基本相同。但上樣量1 000 μg時(shí)檢測(cè)到的蛋白數(shù)量較多，且蛋白斑點(diǎn)多呈橢圓形，聚焦效果好，如圖4所示。本研究表明，紫穗槐菌根蛋白中含有大量低豐度蛋白，而且后續(xù)還要進(jìn)行質(zhì)譜操作，要求蛋白量大，故選用1 000μg作為后續(xù)試驗(yàn)的參考上樣量。

2.2 紫穗槐根蛋白2－DE分析

采用優(yōu)化后的2-DE體系對(duì)接種AM真菌紫穗槐侵染率90%以上時(shí)的菌根蛋白進(jìn)行分析。凝膠圖譜經(jīng)Image Master TM 2D Platinum(Version 7.0)軟件過(guò)濾背景，通過(guò) Smooth、Min area、Saliency參數(shù)對(duì)凝膠圖像上的蛋白點(diǎn)進(jìn)行對(duì)齊、點(diǎn)的匹配分析，結(jié)果如圖5所示。

圖5 紫穗槐菌根蛋白2-DE圖譜分析

經(jīng)過(guò)3次重復(fù)分析可知接種滅活A(yù)M真菌處理CK組共獲得419個(gè)蛋白點(diǎn)，接種AM真菌處理GM組共獲得434個(gè)蛋白點(diǎn)。紫穗槐菌根蛋白雙向電泳圖譜表明AM真菌侵染率90%以上紫穗槐菌根蛋白質(zhì)點(diǎn)的分子量范圍在14.4～96.0 kDa，但主要集中在14.4～66.2 kDa分子量范圍區(qū)域內(nèi)，等電點(diǎn)范圍為 4.2～6.5。

通過(guò) Image Master TM 2D Platinum(Version 7.0)軟件分析顯示，不同處理組蛋白共有32個(gè)蛋白點(diǎn)的表達(dá)豐度變化差異顯著(P＜0.05)。其中14個(gè)蛋白點(diǎn)上調(diào)表達(dá)，Sport number分別為：8、9、11、12、13、20、21、24、26、27、28、29、30、32;3 個(gè)蛋白點(diǎn)下調(diào)表達(dá)，Sport number分別為：1、18、19;15 個(gè)蛋白點(diǎn)僅在GM 處理組中表達(dá)，Sport number分別為：2、3、4、5、6、7、10、14、15、16、17、22、23、25、31。

3 結(jié)論與討論

SDS-PAGE結(jié)果表明，酚提取法蛋白條帶數(shù)目明顯多于TCA丙酮法，具有顯著的差異。本研究進(jìn)一步優(yōu)化了常規(guī)酚提取法，減少了實(shí)驗(yàn)步驟，從而減少人為操作造成的蛋白量的損失;將紫穗槐根組織與提取液與Tris-飽和酚一同研磨并增加了研磨時(shí)間，使樣品破碎更完全，而加入提取液進(jìn)行研磨又可以增加其與樣品蛋白的作用時(shí)間，使提取效果更佳。

針對(duì)與質(zhì)譜兼容的考馬斯亮藍(lán)染色方法入手，本研究對(duì)R-350和R-250兩種染色法進(jìn)行分析。結(jié)果表明，R-350染色后的凝膠膠塊背景較淺，蛋白質(zhì)點(diǎn)之間邊界清晰。而且考馬斯亮藍(lán)R-350較考馬斯亮藍(lán)R-250染色還具有時(shí)間短，操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，故試驗(yàn)選擇染色效果好的R-350作為2-DE體系的染色方法。

試驗(yàn)選用800μg和1 000μg兩種常用蛋白上樣量。上樣量為1 000μg時(shí)檢測(cè)到的蛋白數(shù)量較多，蛋白斑點(diǎn)多呈橢圓形，聚焦效果好。在研究中發(fā)現(xiàn)紫穗槐含有大量低豐度蛋白，而后續(xù)質(zhì)譜鑒定對(duì)蛋白含量要求比較大，故選用1 000μg作為后續(xù)試驗(yàn)的參考上樣量。

采用優(yōu)化的2-DE體系分析了紫穗槐菌根侵染率達(dá)90%以上的菌根蛋白。結(jié)果表明，在雙向電泳圖像上檢測(cè)到400多個(gè)蛋白點(diǎn)，其中上調(diào)表達(dá)蛋白點(diǎn)14個(gè)，下調(diào)表達(dá)蛋白點(diǎn)3個(gè)，特異表達(dá)蛋白點(diǎn)15個(gè)。

在AM真菌與植物互作的過(guò)程中，AM真菌作為外源真菌會(huì)誘導(dǎo)植物的防御反應(yīng)［4，6］。一系列蛋白類(lèi)激酶或者多肽類(lèi)會(huì)參與到植物防御反應(yīng)中［21-22］。因此推測(cè)上調(diào)的蛋白斑點(diǎn)可能與增加植株的抗逆性方面有關(guān)，抗逆性可以很好地保護(hù)宿主植物免受外源性侵害。而當(dāng)AM真菌與宿主植物達(dá)成一致協(xié)議后，宿主植物會(huì)對(duì)有益內(nèi)共生真菌-AM真菌打開(kāi)防御門(mén)戶(hù)［23］，因此下調(diào)的蛋白斑點(diǎn)多肽可能為一些與防御性有關(guān)的蛋白。特異表達(dá)蛋白點(diǎn)可能為AM真菌蛋白，也可能是真菌與宿主植物之間的信號(hào)蛋白。這些差異表達(dá)的蛋白，均由AM真菌共生誘導(dǎo)，可能參與菌根形成過(guò)程的信號(hào)傳導(dǎo)，或者叢枝形成后的營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸，后續(xù)工作將對(duì)此加強(qiáng)研究。

基于雙向電泳膠的局限性，低豐度蛋白、堿性蛋白以及非極性的膜蛋白都不能在常規(guī)2-DE上分離出來(lái)［24］，因此本試驗(yàn)分離出來(lái)的都是可溶性蛋白，其含量在植物體內(nèi)代謝過(guò)程中的變化可以反映細(xì)胞內(nèi)蛋白合成、變性和降解等方面的信息。在AM真菌同宿主植物互作后，宋鴿等［6］報(bào)道了接種AM真菌增加可溶性蛋白的含量，而且隨著菌根共生體的建立，產(chǎn)生一些新的蛋白［25］，原因可能是在AM真菌和宿主植物互作過(guò)程中，宿主植物細(xì)胞組織基因表達(dá)發(fā)生時(shí)空變換，某些基因(如共生相關(guān)基因、病程相關(guān)蛋白基因)會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)而產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白質(zhì)，如參與防御的幾丁質(zhì)酶基因，參與信號(hào)傳導(dǎo)的磷酸化底物，參與基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子，以及參與細(xì)胞形態(tài)改變的細(xì)胞骨架蛋白;同時(shí)又存在消失的蛋白，某些相關(guān)基因的表達(dá)會(huì)被抑制或推遲，甚至是原來(lái)的蛋白質(zhì)被降解，以便附著泡、叢枝、泡囊、入侵栓等特征結(jié)構(gòu)的形成，最后完成叢枝菌根真菌的內(nèi)共生。

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