張宸閣，高雯欣，盧衛(wèi)紅

(1.哈爾濱工業(yè)大學食品科學與工程學院，黑龍江 哈爾濱 150090;2.黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，黑龍江 哈爾濱 150010)

孔石莼(Ulva pertusa Kjellm)是一種石莼科石莼屬的大型綠藻，俗稱為海白菜、海菠菜、豬母菜、海葛茵等。廣泛分布于西太平洋沿海，在我國遼寧、河北、山東和江蘇等沿海均有分布，資源十分豐富［1］。其味甘咸，性寒，有降低膽固醇和清熱解毒、軟堅散結、利水減壓的功效。在民間常利用其與其它藥用植物配合來治療中暑、頸淋巴結腫、甲狀腺腫、瘡疔、急慢性腸胃炎、高血壓、水腫和小便不利、喉炎等病癥［2－3］。

孔石莼藻體中含有大量多糖，均以雜多糖形式存在，水解后可得到多種單糖，包括鼠李糖、葡萄糖、木糖、三碳糖、褐藻糖、甘露糖、半乳糖、和阿拉伯糖等［2］?？资恢泻兴姆N相對分子量的水溶性多糖(151.7、64.5、58.0 和 28.2ku)［4］。有研究顯示，孔石莼多糖具有降血脂，抗病毒，抗腫瘤活性，降膽固醇，抗凝血以及治療心血管疾病等作用［5］。

為了進一步了解不同相對分子量段孔石莼多糖在體內(nèi)條件下對輻照所致哺乳動物肝組織損傷的抑制作用，為孔石莼多糖用于抗輻射作用提供實驗依據(jù)。實驗以小鼠肝臟組織SOD及MDA活性作為實驗依據(jù)，對不同相對分子量段孔石莼多糖拮抗輻照致肝組織損傷的作用進行了探索。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

孔石莼藻體，采集自大連沿海。昆明種小鼠30只，6～10周齡，體質(zhì)量18～22g，均為雄性，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。MDA和SOD試劑盒，由南京建成生物公司提供。

1.2 儀器與設備

CLINAC21EX醫(yī)用電子直線加速器(VARIAN公司，哈爾濱醫(yī)科大學第四醫(yī)院提供);微濾膜(0.45μm，0.25μm，上海市新亞凈化器件廠);超濾膜(30ku，100ku)、超濾杯(上海市摩速科學器材有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同分子量孔石莼多糖的制備

孔石莼藻體粉末經(jīng)85%乙醇80℃回流3次，離心，取沉淀在40℃下減壓干燥，得到脫脂及醇溶性色素的孔石莼藻體。乙醇回流后藻體用20倍蒸餾水于100℃水浴下攪拌提取1h，過濾，取濾液，濾渣再重復提取2次，棄濾渣，合并3次提取的濾液。濃縮后，加入4倍體積95%乙醇進行沉淀，離心，棄上清，得到粗多糖。

通過Sevag法對粗多糖進行脫蛋白，重復2次。經(jīng)過除蛋白處理后的多糖進行濾紙抽濾處理，之后分別用0.45μm和0.25μm微濾膜進行預處理，以除去浸提液中的大分子物質(zhì)。

選擇30Ku和100Ku兩種分子量的超濾膜對預處理后的多糖進行超濾分級，最終將多糖分為≧100Ku分子量、30～100Ku分子量及≦30Ku分子量三種不同分子量段多糖。

1.3.2 模型的建立及肝組織勻漿的制備

將小鼠隨機分為≧100Ku分子量多糖組、30～100Ku分子量多糖組、≦30Ku分子量多糖組，以及空白對照組和輻照對照組，每組6只。

對三個不同分子量段組的小鼠分別進行對應分子量段多糖藥品灌胃，多糖藥品的濃度均為20mg/ml，每天1次，每次0.2mL，連續(xù)灌胃21天;空白對照組及輻照對照組灌服等體積蒸餾水。第21天灌胃后，除空白對照組外各組均通過醫(yī)用電子直線加速器進行4.0Gy劑量輻照。劑量率為1.00Gy/min，照射野為20cm×20cm，皮源距為100cm，輻照后24h頸椎脫臼法處死小鼠。

迅速取出小鼠的肝臟組織，在生理鹽水中清洗后置于研缽中，向其中注入少許液氮，用缽杵進行快速研磨，使肝臟組織充分勻漿化。向研缽中加入一定體積的0.86%冷生理鹽水，充分混合后轉(zhuǎn)移至離心管，補充生理鹽水至加入生理鹽水的總體積為肝臟自身重量的9倍，制備成10%的肝組織勻漿。利用離心機以2 000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，棄沉淀取上清備用。

1.3.3 肝臟組織勻漿蛋白含量的測定

肝臟組織勻漿蛋白含量通過考馬斯亮藍法來測定［6］。

試劑配制:1)BSA標準溶液的配制:在100mL蒸餾水中加入20mg BSA，即為200μg/mL的BSA原液。2)考馬斯亮藍G－250試劑的配制:在50mL 95%(V/V)的乙醇中加入100mg的考馬斯亮藍G－250，充分溶解后加入120mL的85%(W/V)磷酸，用蒸餾水定容到1 000mL。配制好的考馬斯亮藍G－250試劑轉(zhuǎn)移至棕色瓶當中于常溫下可保存1個月。

標準曲線測定:經(jīng)測定0～200μg/mL BSA標準曲線如圖1所示，得到回歸方程:y=0.005x+0.017，R2=0.999 1。

圖1 考馬斯亮藍法測定蛋白的標準曲線

樣品測定:取出根據(jù)標準曲線的測定范圍稀釋的樣品溶液1mL，取考馬斯亮藍G－250試劑5mL加入其中后充分進行震蕩混合，經(jīng)過2min染色后，在595nm波長測吸光度OD595值，并將其代入標準曲線求出樣品相應的蛋白濃度。

1.3.4 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定

按南京建成公司SOD試劑盒說明書來加入試劑。

試劑加入后，充分混勻，在室溫下放置10min，用1cm光徑比色杯于波長550nm處，用蒸餾水進行調(diào)零，進行OD值的測定。

備注:在預實驗中通過抑制率計算公式等最終確定實驗中所取的蒸餾水及樣本量為0.001mL。

計算公式:

1.3.5 脂質(zhì)過氧化物(MDA)含量測定

按南京建成公司MDA試劑盒說明書來加入試劑。

通過漩渦混勻器將其混勻后，將試管口用保鮮膜扎緊，并用針頭在上面捅一個小孔，置于95℃下水浴40min，取出后在流水下對其冷卻。之后在4 000r/min轉(zhuǎn)速下進行低速離心10min，取上清，用1cm光徑比色杯在波長532nm處，用蒸餾水進行調(diào)零，測得各管的OD值。

通常情況下，每批當中應做標準管，標準空白管以及測定空白管1～2支，但由于在預實驗當中發(fā)現(xiàn)測定管中的蛋白含量不是太高，因而測定空白管沒有測定，而是由標準空白管進行替代。

肝組織中MDA含量計算公式:

2 結果與分析

通過1.3.4所示方法測定各組小鼠肝組織TSOD含量，結果如表1，圖2中所示。

從表1中可看出，空白對照組中SOD含量最高，相較之下，其他經(jīng)輻照處理組的SOD含量低很多(P＜0.01)。表明4.0Gy劑量的輻照能導致小鼠肝臟中SOD活性顯著降低。

表1 各組肝組織SOD和MDA含量比較(s)

表1 各組肝組織SOD和MDA含量比較(s)

注:與輻照對照組相比，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 n SOD含量(U/mgprot)MDA含量(nmol/mgprot)6 462.56±10.14 6.85±0.27輻照對照組 6 294.31±7.28 10.27±0.56≧100ku多糖組 6 310.25±11.21* 10.31±0.37 30～100ku多糖組 6 321.74±5.24＊＊ 8.62±0.19＊＊≦30ku多糖組 6 363.93±6.10＊＊ 8.93±0.43空白對照組＊＊

圖2 各組肝臟組織SOD含量比較柱形圖

從圖2可明顯看到，相較于輻照組，各多糖給樣組的T－SOD均有所升高，其中≧100ku多糖組有一定的提高(P＜0.05)，而30～100ku多糖組和≦30ku多糖組兩組則有更為明顯的提高(P＜0.01)，故而可知三種分子量段多糖對輻照降低SOD含量有一定的抑制作用，其中較小的兩種分子量段多糖的這種抑制作用更為明顯。

通過1.3.5所示方法測定各組小鼠肝組織MDA含量，結果如表1，圖3中所示。

從表1中可看出，空白對照組中MDA含量最低，與之相比，其他各組經(jīng)輻照后MDA含量均有明顯上升(P＜0.01)。表明4.0Gy劑量的輻照能導致小鼠肝臟中MDA含量顯著升高。由于MDA能使酶分子中氨基酸發(fā)生交聯(lián)、肽鏈斷裂，形成新的聚合物，從而產(chǎn)生新的大分子，使原來酶活性喪失或改變，破壞細胞的膜結構，使膜內(nèi)外離子交換紊亂加速自由基的產(chǎn)生［7］，故而可推測4.0Gy劑量輻照對小鼠臟器細胞膜結構有不同程度的損害作用。

圖3 各組肝組織MDA含量比較柱形圖

從圖3中各組的對比可看出，輻照可明顯增加肝臟組織當中的MDA的含量。與輻照對照組比較，≧100ku多糖組的MDA含量并無明顯變化，而30～100ku多糖組和≦30ku多糖組兩組則出現(xiàn)了較為明顯的減少(P＜0.01)。由此可知30～100ku和≦30ku兩個分子量段的多糖對輻照提升MDA含量有較為明顯的抑制作用。

3 討論

隨著科學水平的提高及核能技術在各領域的推廣和發(fā)展普及，使得核能與人們平常的生活密不可分，正因為這樣，人體受到放射線輻射傷害的機會也大大增加。前不久日本福島核電站放射性物質(zhì)泄露，對海面及周邊領域造成了大面積的放射性污染，對周圍地區(qū)和國家的居民造成了傷害，這在無形當中都促使著人們加大開展對抑制輻照危害的研究。輻射對機體造成損害，其間接作用于機體內(nèi)水分子，可產(chǎn)生大量的自由基，對機體細胞和組織產(chǎn)生氧化傷害作用。

自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此形成丙二醛MDA等脂質(zhì)過氧化物。MDA具有細胞毒性，會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，對機體細胞造成損傷［8］。因此測定MDA的量常?？煞从硻C體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出細胞損傷的程度。超氧化物歧化酶(SOD)能清除掉超氧陰離子自由基(O－2·)，保護細胞使其免受損傷，故而其在機體的氧化與抗氧化的平衡當中起著至關重要的作用［9］。

通過對SOD活性和MDA含量測定的結果比照發(fā)現(xiàn)，30～100ku和≦30ku兩個分子量段的多糖在小鼠輻照后均明顯提升了其肝臟中SOD的活性并有效降低了其MDA的含量，顯示這兩個分子量段的多糖對肝臟有一定的輻射損傷保護作用。

本研究實驗通過不同組小鼠肝臟組織SOD及MDA活性含量測定比較對不同分子量段孔石莼多糖致輻照引起的小鼠機體氧化損傷的抑制作用進行了初步研究。結果顯示，在三種分子量段的孔石莼多糖組中，小鼠的SOD活性與輻照對照組的相比，三個多糖組均有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)，其中30～100ku和≦30ku兩個分子量段多糖組均具有明顯的差異(P＜0.01);小鼠的MDA活性與輻照對照組的相比，≧100ku分子量段多糖組無顯著性差異，而30～100ku和≦30ku兩個分子量段多糖組均具有明顯的差異(P＜0.01)。說明低分子量段孔石莼多糖對輻照引起的小鼠肝臟的氧化傷害產(chǎn)生了明顯的抑制作用。

從本次實驗的結果，可以初步得出這樣的結論:低分子量段孔石莼多糖對小鼠肝臟組織的氧化損傷具有一定的保護功能，可作為臨床上應用輻照進行腫瘤理療及其他高輻射環(huán)境下作業(yè)時的輔助用藥，對于降低輻照致動物肝臟組織損傷具有重要的意義。但是，全面評價孔石莼多糖抑制輻照的肝臟組織氧化損傷作用，揭示其抗誘變作用的物質(zhì)基礎和機理，以及單一分子量段孔石莼多糖抗輻射抗氧化的量效關系還需要進一步的深入研究。

［1］杭金欣.浙江沿海藻類與原色圖譜［M］.杭州:浙江科技出版社，1983:10－11.

［2］蘇秀榕，李太武，常少杰.孔石純營養(yǎng)成分的研究［J］.中國海洋藥物，1997，61(1):33 －35.

［3］中國人民解放軍海軍后勤部衛(wèi)生部、上海醫(yī)藥工業(yè)研究所合編.中國藥用海洋生物［M］.上海:上海人民出版社，1977:5－6.

［4］Hui MQ，Ting TZ，Quan BZ，et al.Antioxidant activity of different molecular weight sulfated polysaccharides from Ulva pertusa Kjellm(Chlorophyta)［J］.Journal of Applied Phycology，2005，17:527 －534.

［5］臧笑雪.孔石純多糖的分離和結構研究［D］.青島:中國海洋大學，2006.

［6］梁軍，夏永剛，楊炳友，等.麻黃多糖中蛋白含量測定及脫蛋白方法的比較［J］.中醫(yī)藥學報，2011，39(2):73 －75.

［7］王海鳳，鐘秀會，李清艷，等.IBV感染雛雞血清中SOD，GSH－Px活性與MDA含量的研究［J］.畜牧與獸醫(yī)，2008，40(12):11－14.

［8］韋素珍，黃艷蓮，陸貽遜，等.黃精提取液對老齡小鼠心、腦SOD和 MDA 含量的影響［J］.中國醫(yī)藥導報，2010，7(9):31－32.

［9］張燕，李桂芳，任秀敏，等.鼻息肉組織和血清中MDA含量及ADA、SOD活性的測定及其意義［J］.山東大學耳鼻喉眼學報，2010，24(6):24 －26.