韓 斌，龐志剛，劉 超，陳文超，陸 旭，王廣田

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科，河南鄭州450014)

肝細(xì)胞癌(HCC)是典型的多血供、高惡性、易轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤，血管生成是其發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的必要環(huán)節(jié)，多種血管生成因子參與其腫瘤血管生成調(diào)節(jié)［1］。近年來發(fā)現(xiàn)血管生成素(Ang)及其受體與多種腫瘤血管生成有關(guān)［2－3］，但其與 HCC的關(guān)系鮮有報道。本研究采用免疫組化法檢測36例肝細(xì)胞癌組織中Ang-1和Ang-2的表達(dá)，并以CD34標(biāo)記檢測HCC組織的微血管密度(MVD)，探討Ang與HCC病理特征和血管生成的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2004年至2006年我院手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的HCC存檔蠟塊標(biāo)本36例，其中30例帶有癌旁組織，所有入組病例臨床資料均完整。男性30例，女性6例，年齡30～67歲，平均年齡48.8歲。臨床病理特征:AFP陽性28例，AFP陰性8例;HBsAg陽性30例，HBsAg陰性6例;腫瘤直徑≥5 cm 17例，＜5 cm 19例;Edmondson病理分級，Ⅰ級7例，Ⅱ級13例，Ⅲ級8例，Ⅳ級8例;鏡下血管侵犯24例，無血管侵犯12例。結(jié)合影像學(xué)資料及手術(shù)所見，門脈主干有癌栓、肝門部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、同一肝葉主癌灶周圍瘤數(shù)目≥2個或有多個衛(wèi)星結(jié)節(jié)判定為高侵襲轉(zhuǎn)移，共14例;余為低侵襲轉(zhuǎn)移，共22例。5例外傷性肝破裂切除肝組織標(biāo)本為健康對照，均為男性，年齡18～45歲，均無乙肝病史，HBsAg陰性。

1.2 主要試劑 兔抗人Ang-1單克隆抗體、兔抗人Ang-2單克隆抗體、鼠抗人CD34單克隆抗體、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德公司，所有試劑均為濃縮型，工作濃度1∶100。

1.3 檢測方法及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行染色，以PBS替代一抗作陰性對照。Ang-1和Ang-2結(jié)果判斷:細(xì)胞胞漿內(nèi)和(或)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，結(jié)果評分參照文獻(xiàn)［4］:染色強(qiáng)度分級，細(xì)胞基本無著色為0分、淺黃色1分、棕黃色2分、棕褐色3分;染色范圍分級，陽性細(xì)胞比率0% ～5%為0分、6% ～25%為1分、26% ～50%為2分、50%以上為3分;將每張切片2項(xiàng)得分相乘，≥4分為陽性，＜4分為陰性。MVD的判定:先用100倍光鏡掃視整個切片，尋找高血管密度區(qū)，再在3個400倍視野下計數(shù)CD34陽性細(xì)胞，取其平均值為結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，計量資料比較用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Ang-1和Ang-2的表達(dá) 5例正常肝組織標(biāo)本中，Ang-1陽性者3例，Ang-2均為陰性。HCC組織及癌旁組織中Ang-1和Ang-2均有不同程度的表達(dá)，陽性細(xì)胞主要是腫瘤細(xì)胞，癌旁部分肝細(xì)胞也有陽性表達(dá)，均為胞漿著色，其中Ang-2的陽性表達(dá)情況見圖1。Ang-1在HCC組織和癌旁組織中的陽性率分別為44.44%(16/36)和 53.33%(16/30)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.518，P ＞0.05);HCC 組織與正常肝組織中Ang-1的表達(dá)差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.427，P＞0.05)。Ang-2在HCC組織和癌旁組織中的陽性率分別為 83.33%(30/36)和 33.33%(10/30)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=17.135，P ＜0.05)。

2.2 MVD的檢測結(jié)果 36例HCC組織的平均MVD為22.56 ±9.38，Ang-1 陽性者為 21.08 ±11.26，陰性者為23.24 ±8.02，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.754，P ＞0.05);Ang-2 陽性者為 28.48 ± 10.36，陰性者為14.22 ±11.02，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.359，P ＜0.01)。HCC組織中MVD情況見圖2。

2.3 Ang-1和Ang-2與HCC不同臨床病理特征的關(guān)系 Ang-2表達(dá)與血管侵犯、侵襲轉(zhuǎn)移程度有關(guān)(P＜0.05)，而與其他臨床病理學(xué)特征無關(guān)(P＞0.05)。Ang-1表達(dá)與各臨床病理學(xué)特征無關(guān)(P＞0.05)。見表1。

3 討論

Ang是由血管內(nèi)皮分泌的血管源性生長因子，是酪胺酸激酶受體Tie-2的配體，Ang家族包括Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4共4個成員，其中Ang-1和Ang-2是最有效的血管新生調(diào)節(jié)因子。Ang-1廣泛表達(dá)于胚胎和成人，在人體內(nèi)，Ang-1主要作用是通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞與周圍細(xì)胞的黏附從而促進(jìn)并維護(hù)已形成血管的完整性。Ang-2在人類和小鼠體內(nèi)，選擇性表達(dá)于卵巢、子宮和胎盤，主要作用是降低細(xì)胞與基質(zhì)和細(xì)胞與細(xì)胞之間的聯(lián)系，同時Ang-2通過與Ang-1競爭性結(jié)合Tie-2從而阻斷Ang-1的作用［5］。

本研究發(fā)現(xiàn)HCC組織過表達(dá)Ang-2，其陽性率明顯高于癌旁組織，正常肝組織則無表達(dá)，且Ang-2表達(dá)陽性者M(jìn)VD明顯升高，由此推測Ang-2與HCC腫瘤血管生成有關(guān)。而Ang-1在正常肝組織、HCC組織、癌旁組織中均有陽性表達(dá)，陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，Ang-1表達(dá)陽性者腫瘤MVD無明顯升高，說明Ang-1可能是正常存在的血管生成因子，與新生血管的穩(wěn)定和成熟有關(guān)，與HCC腫瘤血管生成無關(guān)。有研究［6］認(rèn)為過表達(dá)的Ang-2誘導(dǎo)血管退化發(fā)生，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)水平較高時，Ang-2競爭抑制Ang-1效應(yīng)，血管結(jié)構(gòu)松解，基底膜和周圍細(xì)胞對血管形成的限制減弱，內(nèi)皮細(xì)胞對VEGF的敏感性增加，并導(dǎo)致新的毛細(xì)血管形成，腫瘤血管壁保持稀薄而有較高的滲漏性的特點(diǎn)，使腫瘤細(xì)胞得以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)Ang-2與腫瘤血管侵犯、侵襲轉(zhuǎn)移程度有關(guān)，也支持這一觀點(diǎn)。

有研究［7］發(fā)現(xiàn)Ang-2與HCC的腫瘤大小、病理分級等有關(guān)，本研究未能得出類似結(jié)論，這可能與樣本量及研究方法不同有關(guān)。另外腫瘤血管生成又是一個復(fù)雜的生理過程，血管生成因子在其中起不同的作用，組織微環(huán)境也有不同的影響，缺氧等微環(huán)境可調(diào)節(jié)各種血管生長因子的分泌［8］。HCC組織中可能存在Ang-2與Ang-1比例的失調(diào)、Ang-2與VEGF的協(xié)同作用，尚需進(jìn)一步研究闡明。

綜上所述，作者認(rèn)為HCC組織中Ang-2高表達(dá)，且與腫瘤血管生成有關(guān)，檢測Ang-2有助于判斷腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力，但不能反映惡性程度。

［1］Norrby K.In vivo models of angiogenesis［J］.J Cell Mol Med，2006，10(3):588－612.

［2］Bach F，Uddin FJ，Burke D.Angiopoietins in malignancy［J］.Eur J Surg Oncol，2007，33(1):7 －15.

［3］湯地，周奇，梁力建，等.VEGF、ANG-1、ANG-2、TSP-1 的表達(dá)與膽管細(xì)胞性肝癌血管生成和侵潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系［J］.中國病理生理雜志，2007，23(10):2046 －2050.

［4］馬鐵祥，王志明.血管生成素－2，VEGF和bFGF在人肝細(xì)胞肝癌中表達(dá)及意義［J］.醫(yī)學(xué)臨床研究，2006，23(3):336 －339.

［5］Yancopoulos GD，Davis S，Gale NW，et al.Vascular-specific growth factors and blood vessel formation［J］.Nature，2000，407(6801):242－248.

［6］Torimura T，Ueno T，Kin M，et al.Overexpression of angiopoietin-1 and angiopoietin-2 in hepatocellular carcinoma［J］.J Hepatol，2004，40(5):799 －807.

［7］李金明，謝南，黃義華，等.Ang-2和Tie-2在肝癌中表達(dá)及血管生成關(guān)系的研究［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2011，26(3):150 －152.

［8］朱正亞，王可凡，張華梁，等.腫瘤抗血管生成的研究進(jìn)展［J］.腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2011，24(5):444 －447.