徐三

(東陽市疾控中心 浙江東陽 322100)

結核分枝桿菌的檢驗與分型

徐三

(東陽市疾控中心 浙江東陽 322100)

目的結核患者的結核分枝桿菌檢驗和分型。方法采用PCR及瓊脂糖凝膠電泳技術,針對124株結核分枝桿菌的6個可變重復位點做了檢驗,并應用Gel－Proanalyzer3.0軟件及BioNumerics(Version3.0)軟件對檢驗結果做了相關的基因型分析,又分析了基因檢測與分型之間的關系。結果136株結核分枝桿菌共分為37個不同的VNTR類型,成簇基因型占74.26%(101/136),單一基因型占25.74%(35/136)。結論耐藥菌株的檢測在分布上存在統(tǒng)計學的差別。

結核分枝桿菌 檢驗 分型

在分子生物學發(fā)展的今天,我們通常利用可變數(shù)目串聯(lián)重(variablenumbertan demrepeat,VNTR)分型技術對結核分枝桿菌的檢驗與分型,它具有操作簡單,分型信息為數(shù)字型的,是可以重復的,實驗室內(nèi)與實驗室間具有可比性,所以用大量樣本做了分析,通過對結核分枝桿菌的檢驗和檢測,得出的結核桿菌的檢驗與分型數(shù)據(jù),也為各項研究提供了依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株的來源

菌株的來源：由結核病防治所提供的136株結核分枝桿菌菌株,通過臨床分離株進行分析。

1.2 主要實驗試劑

TaqDNA聚合酶、dNTP、GoldViewTMDNA染料的準備;實驗中所用PCR材料的準備;100bpDNAladder的購進。

1.3 主要實驗儀器

生物安全柜、臺式高速離心機、培養(yǎng)箱、DNA的自動擴增儀、恒壓恒流電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)。

1.4 所用到的軟件

BioNumerics方面的,進行統(tǒng)計分析的軟件;利用SPSS做統(tǒng)計工作的軟件。

2 結果

(1)對136株臨床分離株的菌種進行鑒定后的結果。利用PNB及TCH對136株臨床分離菌做實驗,利用它在培養(yǎng)基中所出現(xiàn)的問題對結核分枝桿菌、牛分枝桿菌和非結核性分枝桿菌做進一步的分析,得到的最后結果：136株臨床分離株被鑒定為結核分枝桿菌。

(2)136株結核分枝桿菌的藥敏結果。在對菌株研究的過程中,所得到的結果是：完全敏感菌株有102株,占75%(102/136),耐藥菌株34株,占到最25%(34/136)。

(3)136株結核分枝桿菌VNTR結果。在有經(jīng)驗的專家進行了研究以后,我又選用了8個基因位點做了進一步的研究,對這里選用的136株結核分枝桿菌進行了相關的檢驗,也H37RV做了相關數(shù)據(jù)的對照,得用100bpDNAMarker進行了分子量的對比,主要表現(xiàn)為11個分子量的標準帶,數(shù)據(jù)顯示如下100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000bp及1500bp。通過上面的結果可以知道存在于同一位點的擴增片段的大小是不同的,菌株在不同位點的DNA指紋圖譜具有多態(tài)的特性。

(4)菌株的VNTR位點會出現(xiàn)重復出現(xiàn),這里的重復次數(shù)及位點的等位基因其具有的多態(tài)性不同而出現(xiàn)不同的VNTR指紋圖譜,可以根據(jù)別的待檢驗菌株的DNA條帶為選點,對分子量大小做出分析與統(tǒng)計,再以每個菌株位點的不同,根據(jù)重復次數(shù)再進行計算。這樣可以得出136株結核分枝桿菌的等位基因的多態(tài)性,結果顯示為：各位點具有不同的等位基因的多態(tài)性,而MTUB21位點的多態(tài)性相對高一些,即0.575,ETR－B位點的多態(tài)性相對低一些,即0.309。

3 討論

此項研究是對結核患者的136株結核分枝桿菌的基因分型與檢驗,以上結果表明了該地區(qū)耐藥結核分枝桿菌在臨床分離菌株中占有一定的比例(25%),比我國在2000年所做的結核病流行病學的調(diào)查結果要低,這里的耐藥結核的預防和控制在所有的結核病治療、預防和控制中有著重要的意義,特別是對耐多藥結核病的預防與控制顯得特別重要。

3.1 結核病患者的VNTR指紋特征的多態(tài)性分析

在該研究中對6個位點進行了研究,對VNTR基因進行了分析,對菌株的等位基因的多態(tài)性做出了統(tǒng)計與分析以后,得到了6個位點的等位基因分別具有多態(tài)性這一特點,它的多態(tài)性在0.309～0.575之間。這一項結果是在VNTR基因分型技術所得到的,它為可變數(shù)目串聯(lián)重復序列的篩選及確定提供了可靠的數(shù)據(jù)。通過對6個VNTR位點的統(tǒng)計與分析,在BioNumerics軟件的輔助下,做了聚類的分析,136株結核分枝桿菌中有37個基因型。有34(25%)位患者的分離株可確定為單一基因型。

3.2 VNTR類型與成簇的關系分析

在研究中對初治結核病患者的顯示了較高的成簇率,顯示出該地區(qū)的結核病患者相互間有所感染,當?shù)亟Y核病發(fā)病有復燃現(xiàn)象,而復治的結核病患者的成簇率較低,大概是因為內(nèi)源性復燃所導致,也就是因為治療失敗所引起,有些不是續(xù)發(fā)所導致。

[1]孫冰梅,車志宏.結核分枝桿菌耐藥的分子機制及耐藥基因檢測方法的研究進展[J].山西醫(yī)藥雜志,2005,4(4)：301～303.

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1672-5654(2012)03(a)-0034-01

2012-02-15