黃偉聰，王玨，，楊凱，曠文安，張浩，孫成超

（1.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 心胸外科，浙江 溫州 325000；2.北京阜外心血管病醫(yī)院 再生醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京 100037）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）具有取材方便、能進(jìn)行體外培養(yǎng)、免疫原性低、可誘導(dǎo)分化成不同類型的成熟細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為再生醫(yī)學(xué)研究中的熱點(diǎn)種子細(xì)胞，在心血管疾病及其他疾病的治療中有著廣泛的研究和應(yīng)用前景[1-2]。但是，由于BMSCs在骨髓中原始數(shù)量少，需要長(zhǎng)時(shí)間的體外擴(kuò)增才能達(dá)到臨床研究和應(yīng)用的數(shù)量要求，因此增強(qiáng)BMSCs增殖的能力在臨床干細(xì)胞研究和治療應(yīng)用中至關(guān)重要。

miRNAs是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，長(zhǎng)度在20～23個(gè)核苷酸，在種屬間具有高度保守性，其通過(guò)抑制靶點(diǎn)mRNA的翻譯或者促進(jìn)降解而對(duì)基因的表達(dá)發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，參與調(diào)控生命細(xì)胞水平的一系列重要進(jìn)程，包括細(xì)胞增殖、凋亡、分化及腫瘤形成等[3]。體外研究中發(fā)現(xiàn)miRNA-133b對(duì)心臟成纖維細(xì)胞、心肌祖細(xì)胞及平滑肌內(nèi)皮細(xì)胞增殖具有調(diào)控作用[4-6]。本研究為了確定miRNA-133b對(duì)BMSCs的作用，在體外培養(yǎng)條件下，利用siPORT NeoFX轉(zhuǎn)染rno-miRNA-133b模擬物（mimic）/抑制劑（inhibitor）至大鼠來(lái)源的BMSCs，上調(diào)/抑制細(xì)胞中miRNA-133b活性以探討其對(duì)BMSCs增殖和凋亡的影響，并利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)其靶點(diǎn)基因，初步分析miRNA-133b影響B(tài)MSCs增殖的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Spraque Dawley（SD）大鼠由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量60 g，研究經(jīng)溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、PBS、青鏈雙抗、胰蛋白酶（北京四環(huán)生物有限公司），胎牛血清FBS（美國(guó)Gibco公司）。MTS細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Promega公司），Brdu細(xì)胞增殖比色法測(cè)定試劑盒（美國(guó)eBioscience公司）。TUNEL熒光法凋亡檢測(cè)試劑盒（德國(guó)Roche公司），rno-miR-133b mimic、inhibitor及其陰性對(duì)照（NC）（上海吉瑪公司）。rnomiR-133b mimic序列為sense：5’-UUUGGUCCCCUUCAA CCAGCUA-3’，antisense：5’-GCUGGUUGAAGGGGACCAAA UU-3’；rno-miR-133b mimic NC序列為sense：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，antisense：5’-ACGUGA CACGUUCGGAGAATT-3’；rno-miR-133b inhibitor序列為5’-UAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3’；rno-miR-133b inhibitor NC序列為5’-CAGUACUUUUGUGUAGUA CAA-3’。SiPORT NeoFX轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)ABI公司）。

1.3 儀器設(shè)備 細(xì)胞培養(yǎng)超凈臺(tái)GB-II（北京長(zhǎng)城空氣凈化設(shè)備公司），CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司），酶標(biāo)儀Model680（美國(guó)BIO-RAD公司），realtime-PCR儀7300（美國(guó)AB公司），熒光顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)：原代培養(yǎng)大鼠BMSCs，無(wú)菌條件下分離大鼠的股骨和脛骨，以適量DMEM沖出骨髓，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基，以后每2～3 d更換培養(yǎng)基，細(xì)胞融合70%～80%時(shí)用胰蛋白酶消化傳代，取生長(zhǎng)良好的2代細(xì)胞，更換成含5% FBS的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 轉(zhuǎn)染及實(shí)驗(yàn)分組：rno-miR-133b mimic、inhibitor及其各自NC干粉加適量DEPC水配置成終濃度為30μmol/L的工作液。細(xì)胞接種后，按照siPORT NeoFX說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并分為4組：過(guò)表達(dá)組（miR-133b mim組）、過(guò)表達(dá)組陰性對(duì)照組（NC-mim組）、抑制組（miR-133b inh組）、抑制組陰性對(duì)照組（NC-inh組），按目的繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)：TaqMan qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，接種第二代BMSCs于T25培養(yǎng)瓶中，按1.4.2方法轉(zhuǎn)染及分組，培養(yǎng)24 h后按照Trizol試劑盒說(shuō)明提取各組總RNA，利用TaqMan miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和TaqMan miRNA探針在realtime-PCR儀上行定量PCR，結(jié)果以u(píng)6 snRNA為內(nèi)參，利用2-ΔΔCt方法計(jì)算目標(biāo)miRNA-133b的相對(duì)表達(dá)水平。免疫熒光轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)，用siPORT NeoFX轉(zhuǎn)染帶GFP熒光的miRNA于6孔板中爬片的BMSCs，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，更換培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定，Dil染細(xì)胞膜，DIAP染核，熒光顯微鏡下觀察并記錄。

1.4.4 MTS和Brdu法檢測(cè)細(xì)胞增殖：取生長(zhǎng)良好的第二代BMSCs，以每孔1.5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，按1.4.2方法同期做細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組，每組設(shè)6孔。于轉(zhuǎn)染后24、48和72 h用MTS法各檢測(cè)一塊板，檢測(cè)時(shí)每孔加入20μL MTS檢測(cè)試劑，并設(shè)置調(diào)零孔，放于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h后，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)OD490值。另于轉(zhuǎn)染后24 h，于每孔中加入BrdU 10μL，并設(shè)置細(xì)胞背景孔，繼續(xù)培養(yǎng)12～24 h，按照Brdu細(xì)胞增殖比色法測(cè)定試劑盒的說(shuō)明操作，固定細(xì)胞，孵育一、二抗并顯色，于加入終止液半小時(shí)內(nèi)用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)計(jì)算OD450－OD595值。

1.4.5 TUNEL免疫熒光染色：取第二代BMSCs以2.5×105/mL細(xì)胞密度接種6孔板，每孔2 mL進(jìn)行細(xì)胞爬片，按1.4.2方法轉(zhuǎn)染及分組后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，按TUNEL熒光法凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明操作，同期行DAPI細(xì)胞核染色。熒光顯微鏡下每張片隨機(jī)選取9個(gè)視野拍片，計(jì)數(shù)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞所占百分比。

1.4.6 靶基因預(yù)測(cè)及基因功能分類：采用Target-Scan和PicTar兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行miRNA-133b檢索，預(yù)測(cè)其靶點(diǎn)基因，并對(duì)這些靶點(diǎn)基因進(jìn)行初步基因功能分類。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siPORT NeoFX轉(zhuǎn)染miRNA-133b效率檢測(cè) 利用siPORT NeoFX轉(zhuǎn)染帶GFP熒光的miRNA在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，GFP熒光成功出現(xiàn)在BMSCs中（見(jiàn)圖1）。同時(shí)利用TaqMan qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率發(fā)現(xiàn)利用siPORT NeoFX轉(zhuǎn)染的miR-133b mim組較NC-mim組能夠明顯上調(diào)細(xì)胞中的miRNA-133b表達(dá)（P<0.01），而miR-133b inh組較NC-inh組能夠明顯下調(diào)細(xì)胞中的miRNA-133b表達(dá)（P<0.01）（見(jiàn)圖2）。

圖1 熒光顯微鏡下見(jiàn)綠色熒光出現(xiàn)在BMSCs細(xì)胞中（右）（DiL染細(xì)胞膜，DAPI染核，×400）

圖2 TaqMan qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率（以u(píng)6 snRNA為內(nèi)參，計(jì)算與各自的NC組之比：aP＜0.01，n=3)

2.2 miRNA-133b mimic和inhibitor對(duì)BMSCs增殖能力的影響 BMSCs接種于96孔板并行同期轉(zhuǎn)染后24、48和72 h行MTS法檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)（見(jiàn)表1），發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后24～72 h miR-133b mim組OD490值明顯高于NC-mim組（P<0.05）。而轉(zhuǎn)染后24～72 h miR-133b inh組OD490值明顯低于NC-inh組（P<0.05）。相似的結(jié)果在轉(zhuǎn)染后24 h的Brdu細(xì)胞增殖比色法測(cè)OD450－OD595值中再次得到驗(yàn)證（P<0.05）（見(jiàn)表2）。

表1 MTS法檢測(cè)各組OD490值（n=3±s）

表1 MTS法檢測(cè)各組OD490值（n=3±s）

與各自的NC組比：aP＜0.05

組別NC-mim組miR-133b mim組NC-inh組miR-133b inh組24 h 0.459±0.12 0.539±0.12a 0.473±0.11 0.444±0.09a 48 h 0.720±0.13 0.753±0.16a 0.733±0.12 0.686±0.10a 72 h 1.028±0.18 1.100±0.19a 1.014±0.17 0.946±0.13a

表2 Brdu法檢測(cè)各組OD450－OD595值（n=3±s）

表2 Brdu法檢測(cè)各組OD450－OD595值（n=3±s）

與各自的NC組比：aP＜0.05

組別NC-mim組miR-133b mim組NC-inh組miR-133b inh組24 h 0.873±0.05 1.024±0.13a 0.897±0.04 0.810±0.06a

2.3 miRNA-133b mimic和inhibitor對(duì)BMSCs凋亡的影響 TUNEL免疫熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞凋亡情況，DAPI和TUNEL同時(shí)陽(yáng)性（DAPI+-TUNEL+）的細(xì)胞核被認(rèn)為是發(fā)生凋亡的BMSCs，呈現(xiàn)黃綠色熒光（見(jiàn)圖3）。各組在凋亡細(xì)胞百分比上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（見(jiàn)表3）。

圖3 TUNEL熒光染色結(jié)果（DAPI染核，TUNEL，×400）

表3 TUNEL法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡百分比（n=3±s）

表3 TUNEL法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡百分比（n=3±s）

組別NC-mim組miR-133b mim組NC-inh組miR-133b inh組凋亡細(xì)胞百分比（%）4.032±0.13 4.113±0.20 4.250±0.16 4.206±0.19

2.4 miRNA-133b靶基因預(yù)測(cè)及基因功能分類TargetScan和PicTar兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)分析提示，miRNA-133b的靶點(diǎn)中存在部分調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的基因位點(diǎn)（見(jiàn)表4）。

表4 miRNA-133b與細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)相關(guān)部分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)基因

3 討論

BMSCs在臨床干細(xì)胞治療研究和應(yīng)用中具有廣闊前景，但如何提高BMSCs體外擴(kuò)增效率是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度激光照射、改良培養(yǎng)系統(tǒng)及各種細(xì)胞因子刺激等能增強(qiáng)BMSCs的增殖[7-8]，但目前對(duì)miRNAs與BMSCs增殖方面的研究還比較少。研究發(fā)現(xiàn)miRNA-133能夠促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞和心肌祖細(xì)胞的增殖[4-5]，而在血管平滑肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miRNA-133能調(diào)控其表型改變，且功能學(xué)研究中上調(diào)miRNA-133活性能抑制其增殖[6]。相同miRNA在不同細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞增殖調(diào)控結(jié)果的不一致，可能與不同細(xì)胞中特異的基因表達(dá)相關(guān)。本研究為了明確miRNA-133b對(duì)BMSCs增殖和凋亡的作用，利用siPORT NeoFX成功地將rno-miRNA-133b mimics/inhibitors轉(zhuǎn)染至大鼠來(lái)源的BMSCs，并觀察上調(diào)/抑制miRNA-133b活性對(duì)細(xì)胞的影響。結(jié)果表明上調(diào)/抑制miRNA-133b活性，對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)顯著影響，但能夠促進(jìn)/減少BMSCs的增殖，表明miRNA-133b對(duì)BMSCs的增殖能力具有調(diào)控作用。

目前已發(fā)現(xiàn)的miRNA-133家族中主要包括3個(gè)成員，即miRNA-133a-1、miRNA-133a-2和miRNA-133b，它們分別與miRNA-1-2、miRNA-1-1和miRNA-206在不同的染色體上如多順?lè)醋右粯颖煌瑫r(shí)轉(zhuǎn)錄，且miRNA的表達(dá)存在細(xì)胞、組織和器官的特異性，miRNA-133和miRNA-1家族主要在骨骼肌和心肌細(xì)胞中呈高表達(dá)。miRNA-133和miRNA-1通過(guò)調(diào)控Srf、Hand2、CyclinD2、Irx5、Detal等基因參與心肌和骨骼肌細(xì)胞的分化、發(fā)育等過(guò)程[9]。Ning等[10]發(fā)現(xiàn)miRNA-133b能通過(guò)胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF-I）信號(hào)調(diào)控介導(dǎo)脂肪來(lái)源的干細(xì)胞分化。另外在腫瘤學(xué)研究中，miRNA133家族與多種腫瘤的發(fā)生、分化、增殖及遷徙等密切相關(guān)[11-12]。本研究中發(fā)現(xiàn)miRNA-133b能夠促進(jìn)BMSCs數(shù)量的擴(kuò)增，但在臨床研究和應(yīng)用中的生物安全性是否可靠，對(duì)BMSCs分化有無(wú)影響，仍需要更深入地研究。

miRNA 5’端第2～7個(gè)核苷酸被稱為種子序列，可通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與靶點(diǎn)基因的mRNA 3’端非翻譯區(qū)（3’UTR）結(jié)合發(fā)揮基因調(diào)控作用[3]。目前生物信息學(xué)基于miRNA與其靶點(diǎn)基因mRNA 3’UTR的互補(bǔ)配對(duì)的原理，開(kāi)發(fā)了TargetScan、PicTar、RNA22、PITA和miRanda等多種miRNAs靶點(diǎn)基因預(yù)測(cè)軟件。本研究中利用較為常用的TargetScan和PicTar對(duì)miRNA-133b的靶點(diǎn)基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并利用Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這些可能的靶點(diǎn)進(jìn)行初步的基因功能分類，發(fā)現(xiàn)miRNA-133b的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)基因的功能涉細(xì)胞增殖、分化、凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。與細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)相關(guān)的部分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)基因在表4中列出，其中Srf、Furin蛋白在肌成纖維細(xì)胞的增殖調(diào)控中發(fā)揮重要作用[4，13]。Chen等[4]發(fā)現(xiàn)miR-133通過(guò)負(fù)調(diào)控Srf基因增強(qiáng)肌成纖維細(xì)胞的增殖，而后者作為一種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控肌成纖維細(xì)胞中增殖相關(guān)基因的表達(dá)。鑒于肌成纖維細(xì)胞在生物學(xué)特性上與BMSCs具有一定的相似性，miRNA-133b在BMSCs中是否是通過(guò)調(diào)控Srf基因，或者其他的靶點(diǎn)基因發(fā)揮促增殖作用，我們將在下一步研究中進(jìn)行驗(yàn)證。

總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)miRNA-133b在不影響B(tài)MSCs細(xì)胞凋亡的情況下對(duì)其增殖能力具有調(diào)控作用，而在miRNA-133b靶點(diǎn)基因的驗(yàn)證及其對(duì)BMSCs分化上，仍需做進(jìn)一步研究。

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