劉艷濤， 馮曉潔， 席國成， 蒲寶鐘， 王慶雷， 劉春琴

（河北滄州市農(nóng)林科學(xué)院，滄州 061001）

抗黑星病芽變鴨梨組織結(jié)構(gòu)、生理生化與抗病性關(guān)系研究

劉艷濤， 馮曉潔， 席國成， 蒲寶鐘， 王慶雷， 劉春琴＊

（河北滄州市農(nóng)林科學(xué)院，滄州 061001）

對一株抗黑星病芽變‘鴨梨’的葉片組織結(jié)構(gòu)和生理生化特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其葉片蠟質(zhì)含量高、柵欄組織雙層出現(xiàn)時間早、厚度大、海綿組織結(jié)構(gòu)致密、氣孔數(shù)目少，推斷這些特性決定黑星病菌分生孢子不易侵入葉片內(nèi)部；葉綠素含量高為植株抗病性提供了生理基礎(chǔ)，可溶性糖含量低有可能抑制黑星病營養(yǎng)菌絲在細(xì)胞間的生長和擴(kuò)展。通過研究該抗黑星病芽變‘鴨梨’的抗病機(jī)理，為‘鴨梨’抗黑星病育種提供了理論依據(jù)。

鴨梨； 黑星??； 抗病性； 組織結(jié)構(gòu)； 生理生化

梨黑星病又稱瘡痂病，是在我國北方梨區(qū)發(fā)生和危害的一種主要病害，可危害葉片、葉柄、新梢、果實(shí)、果柄、芽、花序等部位［1］。發(fā)病嚴(yán)重時往往造成大量幼果畸形、果實(shí)不能正常膨大、落果、早期大量落葉等，病樹第2年結(jié)果減少，常在梨生產(chǎn)上造成重大損失［2－3］。不同梨品種間對梨黑星病菌的抗性存在著明顯的差異［4－5］，以中國梨最感病。中國梨中的‘鴨梨’尤其容易感染黑星?。?］。因此培育高抗梨黑星病的優(yōu)良品種，是解決這一問題的關(guān)鍵，是減少農(nóng)藥污染，提高經(jīng)濟(jì)效益，生產(chǎn)綠色優(yōu)質(zhì)果品的最有效措施。

關(guān)于梨葉片組織結(jié)構(gòu)和生理生化與黑星病抗性之間關(guān)系，姜淑苓等［7］用‘早金香梨’為材料對其葉片組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，認(rèn)為葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織的致密程度以及表皮蠟質(zhì)的厚度均與黑星病抗性有關(guān)。李保華等［8］認(rèn)為葉齡與黑星病的侵染和發(fā)病均有關(guān)系。樊衛(wèi)國等［9］對部分梨砧木葉片組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，認(rèn)為葉片組織結(jié)構(gòu)與其抗旱性有相關(guān)性。

王躍進(jìn)等［10］認(rèn)為葡萄葉片可溶性糖含量與抗黑痘病存在著顯著的相關(guān)關(guān)系；楊光道等［11］也發(fā)現(xiàn)油茶果實(shí)可溶性糖含量與抗炭疽病之間存在著顯著的相關(guān)關(guān)系。而萬賢崇等［12］則認(rèn)為楊樹感染褐斑病初期體內(nèi)高含量的可溶性糖、還原糖是感病無性系易于感病的重要因素。蘇海蘭等［13］認(rèn)為葡萄葉綠素與抗病性有顯著相關(guān)。劉會寧等［14］對葡萄霜霉病的研究結(jié)果也表明葉綠素含量與霜霉病有顯著關(guān)系。然而馮麗貞［15］以桉樹為試驗(yàn)材料結(jié)果卻表明接種前桉樹體內(nèi)葉綠素含量和葉綠素a／b值與桉樹對焦枯病抗性不呈正比；而接種后桉樹的葉綠素含量和葉綠素a／b值的變化率卻可以反映出桉樹抗焦枯病能力的大小。

本試驗(yàn)以滄州泊頭市梨園內(nèi)一株生產(chǎn)栽培表現(xiàn)良好的10年生抗黑星病芽變‘鴨梨’為材料，通過對該抗黑星病芽變‘鴨梨’的組織結(jié)構(gòu)、生理生化方面的研究，分析其與黑星病抗性之間的關(guān)系，為‘鴨梨’抗黑星病育種提供理論依據(jù)，豐富育種資源；減少農(nóng)藥污染，提高經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料

滄州泊頭市梨園內(nèi)一株10年生抗黑星病芽變‘鴨梨’為鑒定材料，同一梨園內(nèi)長勢一致的普通‘鴨梨’品種為對照。

1.2 方法

1.2.1 抗病性鑒定方法

于下午16：00－17：00或陰雨日進(jìn)行人工接種，以105個／mL孢子懸浮液噴霧接種葉片，接種后套袋保濕24h，葉片發(fā)病后觀察、記錄發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)。

葉片分級標(biāo)準(zhǔn)為：0級為葉片無病斑；1級為病斑面積占整片葉面積的10%以下；3級為病斑面積占整片葉面積的11%～25%；5級為病斑面積占整片葉面積的26%～40%；7級為病斑面積占整片葉面積的41%～65%；9級為病斑面積占整片葉面積的65%以上［16］。

梨黑星病病情指數(shù)計(jì)算：

抗病性評價標(biāo)準(zhǔn)為：病情指數(shù)＜10.0為高抗（HR）；10.0≤病情指數(shù)＜25.0為抗?。≧）；25.0≤病情指數(shù)＜40.0為中抗（M）；40.0≤病情指數(shù)＜65.0為感?。⊿）；病情指數(shù)≥65.0為高感（HS）。

1.2.2 葉片組織結(jié)構(gòu)、生理生化鑒定方法

1.2.2.1 蠟質(zhì)含量測定

參照李海英等的方法［17－18］，取每個品種的新鮮葉片稱重后，剪碎，放入40mL的氯仿中浸泡1min，把溶液過濾到已知重量的燒杯中，在通風(fēng)柜中待氯仿?lián)]發(fā)完畢后，再次稱重，換算出蠟質(zhì)含量。

1.2.2.2 葉片氣孔觀察

每品種觀察9片葉，每個葉片選取3片1cm×1cm大小的部位剪下，在等量的95%乙醇和冰醋酸混合液中固定24h，然后浸在飽和水合氯醛水溶液中，待組織透明后，10×40倍顯微鏡下觀察氣孔數(shù)目；15×40倍顯微鏡下通過測微尺測量氣孔大小。

1.2.2.3 葉片組織結(jié)構(gòu)觀察

每葉各取6個不同部位，制作切片，在15×10倍顯微鏡下測量葉片上、下表皮組織、柵欄組織、海綿組織及整個葉片的厚度，計(jì)算細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度。

細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度（CTR）＝

（柵欄組織厚度／葉片厚度）×100%。

1.2.2.4 葉綠素和可溶性糖含量測定

葉綠素含量的測定［19］：取新鮮梨葉，擦凈表面污物，剪碎并準(zhǔn)確稱量0.5g，放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣及3mL 80%丙酮，研磨勻漿，再加入80%丙酮10mL，繼續(xù)研磨至組織變白，把提取液倒入小燒杯中，加入少量80%丙酮沖洗研缽3次，靜置數(shù)分鐘，用一層經(jīng)80%丙酮濕潤過的濾紙過濾，再用80%丙酮將紙上色素沖洗干凈定容于25mL容量瓶中搖勻，每品種均設(shè)3次重復(fù)。

將上述色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)，以80%丙酮為空白，在波長663、646、652nm和470nm下測定吸光度。

可溶性糖的測定［19］，稱取新鮮梨葉0.3g剪碎混勻，放入20mL試管中，加入10mL蒸餾水并用塑料膜封口，于沸水提取30min過濾，反復(fù)漂洗試管及殘?jiān)?，最后定容?5mL容量瓶中，取待測液0.5mL加入蒽酮乙酸乙酯0.5mL和5mL濃硫酸顯色，充分振蕩后立即沸水浴1min，自然冷卻至室溫后用753B型分光光度計(jì)在波長620nm下測定吸光度，每品種均設(shè)3次重復(fù)。

用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液按同樣步驟做標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得總糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘鴨梨’抗黑星病鑒定結(jié)果

田間正常管理?xiàng)l件下，通過兩年的田間調(diào)查可知，作為對照的‘鴨梨’（CK），葉片發(fā)病率達(dá)95%以上，病情指數(shù)82，表現(xiàn)為高感；而該芽變‘鴨梨’葉片發(fā)病率為6%，病情指數(shù)為3，表現(xiàn)為高抗。對照品種‘鴨梨’梨黑星病病葉率為28.0%～70.5%，病果率為25.0%～63.0%。

表1 ‘鴨梨’對梨黑星病抗性鑒定結(jié)果1）

2.2 ‘鴨梨’葉片顯微結(jié)構(gòu)

圖1和圖2分別為抗病芽變‘鴨梨’和普通‘鴨梨’（CK）葉片切片后的顯微照片，從圖1可以看出：5月2日的抗病‘鴨梨’葉片柵欄組織較厚，即為明顯的兩層，海綿組織致密；而普通‘鴨梨’葉片柵欄組織較薄，僅為一層。從圖2可以看出至5月12日抗病芽變‘鴨梨’和普通‘鴨梨’（CK）均為明顯的雙層?xùn)艡诮M織。

2.3 ‘鴨梨’組織結(jié)構(gòu)、生理生化指標(biāo)鑒定結(jié)果

從表2可以看出：（1）抗病芽變材料蠟質(zhì)含量為對照‘鴨梨’的1.2～1.6倍，5月2日、5月12日芽變材料和對照‘鴨梨’的蠟質(zhì)含量達(dá)極顯著水平。（2）芽變材料葉片厚度與對照‘鴨梨’厚度相當(dāng)，但柵欄組織厚度為對照‘鴨梨’的1.2～1.4倍；細(xì)胞結(jié)構(gòu)更致密。（3）在整個觀察期間芽變材料的氣孔數(shù)目均比對照‘鴨梨’的氣孔數(shù)目少，為對照‘鴨梨’的0.8～0.9倍。（4）方差分析表明，芽變材料和對照‘鴨梨’在柵欄組織厚度、細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度、氣孔數(shù)目方面存在著極顯著差異。

從表3可以看出（1）抗病芽變材料葉綠素含量為對照‘鴨梨’的1.3～1.8倍。（2）抗病芽變材料可溶性糖含量在5月12日前為對照‘鴨梨’的0.7～0.8倍；5月12日后猛增到對照‘鴨梨’的1.4倍以上，達(dá)到顯著水平。

表2 抗病芽變材料與普通‘鴨梨’組織結(jié)構(gòu)比較1）

表3 抗病芽變材料與普通‘鴨梨’生理生化指標(biāo)比較1）

以上研究結(jié)果表明：在相同栽培管理?xiàng)l件下，芽變材料與對照‘鴨梨’相比，（1）蠟質(zhì)含量高，葉面更光滑，使孢子著落量降低；（2）柵欄組織雙層出現(xiàn)時間早，厚度大，海綿組織結(jié)構(gòu)致密，推斷病菌分生孢子不易侵入葉片內(nèi)部；（3）從栽培學(xué)角度看，梨樹葉片從展葉到發(fā)育成熟需要30～40d。10日齡前葉片未完全展開，密生絨毛，孢子著落量低，發(fā)病輕；30日齡以后梨葉趨于成熟，毛狀體稀疏，葉面光滑，孢子著落量減少，發(fā)病也輕［20］。正處于生長發(fā)育期的‘鴨梨’葉片抗病性差，易感染黑星??；發(fā)育成熟后，抗病性逐漸增強(qiáng)。該芽變‘鴨梨’5月2日即可見雙層?xùn)艡诮M織，柵欄組織厚，氣孔數(shù)目少，推斷芽變‘鴨梨’的抗病性主要表現(xiàn)在早期抗病；（4）葉綠素含量高，為植物生長提供更充分的營養(yǎng)保障，為植株抗病性提供了生理基礎(chǔ)；（5）芽變材料可溶性糖含量5月2日前為對照‘鴨梨’的0.7～0.8倍，這是否與抑制黑星病營養(yǎng)菌絲在細(xì)胞間的生長和擴(kuò)展有關(guān)還需進(jìn)一步的研究才能確定。

3 討論

目前人們普遍認(rèn)為梨品種對黑星病的抗性受多基因控制，因栽培地區(qū)不同抗病性差異很大，中國是世界第一產(chǎn)梨大國，其中‘鴨梨’占全國梨總面積的22%左右，然而‘鴨梨’極易感染黑星病，給生產(chǎn)造成巨大損失。作者通過試驗(yàn)，鑒定滄州泊頭市梨園一株10年生‘鴨梨’芽變植株高抗黑星病。通過研究，探討了該芽變材料的抗病機(jī)理，為抗病育種提供科學(xué)依據(jù)；該芽變材料可作為親本選育適合該地區(qū)的優(yōu)質(zhì)高抗黑星病的‘鴨梨’新品種，豐富育種資源，服務(wù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

相同栽培條件下通過對芽變‘鴨梨’和對照‘鴨梨’葉片組織結(jié)構(gòu)和生理生化指標(biāo)的比較發(fā)現(xiàn)：葉片厚度、柵欄組織厚度、葉綠素和可溶性糖與‘鴨梨’黑星病抗性有密切關(guān)系。鮑為民等［21］研究認(rèn)為不同梨品種的抗病性與其葉片的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化和對病原物的抑制、抵御有關(guān)。蠟質(zhì)含量高，葉面光滑，使黑星病菌分生孢子著落量降低，起到一定的抗病作用；柵欄組織雙層出現(xiàn)時間早，厚度大，氣孔數(shù)目少是該芽變‘鴨梨’的主要特征，使黑星病菌分生孢子不易侵入葉片內(nèi)部，起到了抵抗黑星病菌的作用，推斷該芽變‘鴨梨’的抗病性主要表現(xiàn)在早期抗病。

抗病品種的葉片對黑星病菌營養(yǎng)菌絲的生長和擴(kuò)展具有明顯的抑制作用［22］。葉綠素含量高，為植物生長提供充分的營養(yǎng)保障，為植株抗病性提供了生理基礎(chǔ)；糖是植物光合作用的產(chǎn)物，是植物體內(nèi)重要的碳水化合物，同時，又是病原菌賴以生存的碳源和能源，因此糖的含量在植物抗病中可能起著重要的作用，可溶性糖含量低有可能抑制黑星病營養(yǎng)菌絲在細(xì)胞間的生長和擴(kuò)展?？共⌒允且粋€十分復(fù)雜的過程，組織結(jié)構(gòu)、生理生化是抗病性的一種外在表現(xiàn)。由于試驗(yàn)材料和數(shù)據(jù)有限，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

［1］夏聲廣.梨樹病蟲害防治原色生態(tài)圖譜［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007：4－7.

［2］趙敏，劉文，吳傳偉，等.浙西北梨區(qū)6種病害發(fā)生特點(diǎn)及防治方法［J］.中國南方果樹，2007，36（6）：73－74.

［3］邱強(qiáng).原色梨樹病蟲害圖譜［M］.北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社，1993：1－5.

［4］李知行.梨樹黑星病的發(fā)病及防治研究［J］.植物病理學(xué)報(bào)，1959，5（2）：65－78.

［5］湯浩茹，冷懷瓊.梨抗黑星病的遺傳育種研究［J］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1993，11（2）：266－272.

［6］陳長蘭.梨樹矮化密植栽培［M］.北京：金盾出版社，1995：158.

［7］姜淑苓，賈敬賢，王斐，等.早金香梨抗黑星病鑒定及組織結(jié)構(gòu)與抗病關(guān)系研究［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（4）：214－217.

［7］李保華，趙美琦.梨樹葉齡與梨黑星病菌侵染發(fā)病的關(guān)系［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2001，28（4）：309－312.

［9］樊衛(wèi)國，李迎春.部分梨砧木的葉片組織結(jié)構(gòu)與抗旱性的關(guān)系［J］.果樹學(xué)報(bào)，2007，25（1）：17－21.

［10］王躍進(jìn)，賀普超.葡萄葉片中有機(jī)酸和糖與抗黑痘病的關(guān)系［J］.北方果樹，1987，12（S1）：41－45.

［11］楊光道，段琳，束慶龍，等.油茶果皮花青素、糖含量和PAL活性與炭疽病的關(guān)系［J］.林業(yè)科學(xué)，2007，43（6）：99－104.

［12］萬賢崇，汪安琳.楊樹糖代謝與褐斑病發(fā)生的關(guān)系［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，19（1）：38－40.

［13］蘇海蘭，陳清西，王玉玲.葡萄抗病性研究進(jìn)展［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2006，8（1）：43－48.

［14］劉會寧，朱建強(qiáng)，萬幼新.幾個歐亞中葡萄品種對霜霉病的抗性鑒定［J］.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2001（3）：64－67.

［15］馮麗貞.桉樹葉綠素含量與焦枯病抗性的關(guān)系［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，37（4）：365－368.

［16］農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所，GB／T 17980.24－2000農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則（一）殺菌劑防治梨黑星?。跾］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2000.

［17］李海英，倪紅濤，楊慶凱.大豆葉片結(jié)構(gòu)與灰斑病抗性的研究I.大豆葉片氣孔密度、茸毛密度與灰斑病抗性的關(guān)系［J］.中國油料作物學(xué)報(bào)，2001，23（3）：52－56.

［18］李海英，劉亞光，楊慶凱.大豆葉片結(jié)構(gòu)與灰斑病抗性的研究II.大豆葉片組織結(jié)構(gòu)與灰斑病抗性的關(guān)系［J］.中國油料作物學(xué)報(bào)，2002，24（2）：58－66.

［19］李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)［M］.北京：高等教育出版社，2000.

［20］山東萊陽農(nóng)業(yè)大學(xué).梨［M］.北京：林業(yè)出版社，1978.

［21］鮑為民，曹三強(qiáng).13個梨品種對黑星病的抗性鑒定［J］.農(nóng)技服務(wù)，2009，26（11）：68－75.

［22］李保華，趙美琦.梨葉抗黑星病作用機(jī)制研究［J］.萊陽農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，20（3）：187－188.

Relationships between scab resistance and leaf tissue structure and physiological characteristics of Yali pear with bud mutation

Liu Yantao， Feng Xiaojie， Xi Guocheng， Pu Baozhong， Wang Qinglei， Liu Chunqin
（CangzhouAcademyofAgricultureandForestrySciences，Cangzhou061001，China）

The relationships between the leaf tissue structure and physiological characteristics and scab resistance of Yali pear with bud mutation were studied.The results showed that the content of leaf wax was high.Two－layer palisade tissue was formed earlier and thicker，and the structure of spongy tissue was compact.The stoma number of 10－d leaves was decreased.We concluded that it was difficult forVenturiapirinaconidia to penetrate leaf tissue.Higher chlorophyll content was the physiological basis of plant disease resistance，and lower content of soluble sugar could inhibit the growth and extension of pear scab between cells.By studying the resistance mechanism of Yali pear with bud mutation against scab，the theoretical basis for scab resistance breeding of Yali pear varieties can be revealed.

Yali pear； scab； disease resistance； tissue structure； physiological characteristic

S 432.22

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.006

2011－12－21

2012－03－04

＊ 通信作者E－mail：WQLei02＠163.com