王 聰， 劉穎超＊， 龐民好， 董金皋

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，保定 071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，保定 071000）

高效液相色譜柱后衍生法測(cè)定農(nóng)田溝渠水中草甘膦殘留

王 聰1， 劉穎超1＊， 龐民好1， 董金皋2＊

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，保定 071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，保定 071000）

為了準(zhǔn)確評(píng)價(jià)草甘膦在農(nóng)田溝渠水中使用后其對(duì)生態(tài)環(huán)境的安全性，建立了高效液相色譜（HPLC）－柱后衍生法對(duì)農(nóng)田溝渠水中草甘膦殘留量的檢測(cè)方法。將田間溝渠水樣中草甘膦經(jīng)次氯酸鈉和鄰苯二甲醛、巰基乙醇衍生化后，采用熒光檢測(cè)器檢測(cè)。衍生劑1（5%）次氯酸鈉添加量100μL／L；衍生劑2硼酸鉀和OPA添加量分別是130g／L和100mg／950mL。草甘膦在0.05～2mg／L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。在農(nóng)田溝渠水中，草甘膦3個(gè)添加水平（0.05、0.5、1mg／L）的平均回收率（n＝5）為98.2%～104.4%，5次測(cè)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～3.6%，方法檢出限為0.05mg／L。該方法靈敏、簡(jiǎn)便、快速，適合于農(nóng)田溝渠水中草甘膦殘留量的檢測(cè)。

高效液相色譜； 柱后衍生； 農(nóng)田溝渠水； 草甘膦

草甘膦（glyphosate，分子式為C3H8NO5P，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1）屬滅生性輸導(dǎo)型莖葉處理劑，具有廣譜、高效、低毒、低殘留的特點(diǎn)。農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用國(guó)際服務(wù)組織 （ISAAA）最新統(tǒng)計(jì)報(bào)告，2009年全世界轉(zhuǎn)基因作物（大豆、玉米、苜蓿等）種植面積已達(dá)1.34億hm2。隨著轉(zhuǎn)基因作物大面積種植，草甘膦在世界除草劑應(yīng)用中越來越受到人們的歡迎，廣泛用于農(nóng)田各種雜草的防除和非農(nóng)田雜草的治理，現(xiàn)已成為應(yīng)用最廣、產(chǎn)量最大的除草劑品種［1－2］。然而，草甘膦的大量使用對(duì)環(huán)境造成的影響是不可忽視的。草甘膦對(duì)人畜低毒，一直以來被認(rèn)為是“安全”的除草劑，但近些年的研究顯示環(huán)境中的草甘膦能夠造成大量益蟲死亡，對(duì)水生生物也具有極強(qiáng)的毒性［3］。朱國(guó)念等通過室內(nèi)外試驗(yàn)，探索了草甘膦對(duì)水蚤、藻類和魚的毒性效應(yīng)以及在水中的殘留動(dòng)態(tài)［4］。此外，草甘膦還能夠使土壤中的微生物種群比例發(fā)生改變，造成一些有益微生物活性降低，土壤有機(jī)質(zhì)含量下降，從而降低土壤的質(zhì)量。鄧曉等研究表明草甘膦對(duì)土壤微生物的種群數(shù)量及土壤中細(xì)菌、放線菌和真菌生長(zhǎng)速率均具有一定的抑制作用［5］。這些研究為保障生物生存環(huán)境的安全提供了科學(xué)依據(jù)。

圖1 草甘膦的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖

雖然草甘膦在防除雜草方面發(fā)揮著良好的作用，但由于其易溶于水，難溶于一般有機(jī)溶劑，缺少發(fā)色團(tuán)和熒光團(tuán)，對(duì)其分析測(cè)定難度很大［6］，尤其在環(huán)境中有其他常見化合物存在情況下，進(jìn)行痕量測(cè)定愈加困難［7］。目前，測(cè)定草甘膦的方法主要有氣相色譜法［8］、氣相色譜－質(zhì)譜法［9］、高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì) 譜 法［10］、高效液 相 色 譜 法［11－14］、離 子 色 譜法［15］、分光光度法［16］、毛細(xì)管電泳法［17］等，但這些方法均具有局限性。例如：氣相色譜法操作步驟繁瑣，重現(xiàn)性差，同時(shí)限制了常用的各種標(biāo)準(zhǔn)衍生技術(shù)；氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法靈敏度高，但成本高且普及率低，前處理繁瑣，不利于大批量樣品處理；分光光度法檢測(cè)的靈敏度低，干擾性大；柱前衍生高效液相色譜法中的柱前衍生試劑易與水反應(yīng)生成副產(chǎn)物，并且有些衍生試劑毒性較大［10］。為了快速、準(zhǔn)確、高靈敏度測(cè)定農(nóng)田溝渠水中草甘膦的殘留，本文建立了高效液相－柱后衍生法測(cè)定農(nóng)田溝渠水中草甘膦含量的方法，試驗(yàn)證明了該方法靈敏度和精確度高，干擾少且成本相對(duì)低，重現(xiàn)性好，能直接進(jìn)樣測(cè)定，適合于大批量樣品的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器

高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Agilent公司）：包括脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、熒光檢測(cè)器（FLD）；PCX5200柱后衍生儀配二元泵（美國(guó)Pick－ering Laboratories公司）；科導(dǎo)SK2210LHC超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；SK－1快速混勻器（上海滬粵科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑

99%草甘膦標(biāo)準(zhǔn)品（上海江萊生物科技有限公司）；磷酸，氫氧化鉀，次氯酸鈉，氯化鈉，氫氧化鈉，磷酸二氫鉀，硼酸鉀，以上均為國(guó)產(chǎn)分析純；甲醇，巰基乙醇（色譜級(jí)，美國(guó) Pickering Laboratories公司），鄰苯二甲醛（OPA，化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），超純水（自制），甘氨酸（Amresco）。

1.3 溶液的配制

流動(dòng)相：鉀洗脫液（0.4%磷酸－0.1%磷酸二氫鉀水溶液；pH＝2）；再生液（0.3%氫氧化鉀水溶液）；

衍生試劑1：5%次氯酸鈉100μL，加入950mL GA116（1% 氯化鈉，0.1%磷酸二氫鉀，0.1%氫氧化鈉水溶液；pH＝12）；

衍生試劑2：100mg OPA用10mL甲醇溶解，同時(shí)與2mL巰基乙醇加入到950mL的GA104（13%硼酸鉀的水溶液；pH＝9.8）中，使用前通氮?dú)馊パ酰?0～15min）。

1.4 HPLC－柱后衍生測(cè)定條件

1.4.1 色譜柱

分析柱：鉀陽離子交換柱（50×4.0mmi.d.），保護(hù)柱：鉀陽離子交換柱（20×3.0mmi.d.）（美國(guó)Pickering Laboratories公司）。

1.4.2 柱后衍生條件

進(jìn)樣體積：10μL；流動(dòng)相流量：0.4mL／min；衍生劑1流速：0.3mL／min；衍生劑2流速：0.3mL／min；柱溫：55℃；柱后衍生反應(yīng)器溫度：36℃；

檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器設(shè)定的激發(fā)波長(zhǎng)λEX＝330nm，發(fā)射波長(zhǎng)λEM＝465nm。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫和流速

1.5 樣品處理

采集不少于1kg農(nóng)田溝渠水樣品，4層紗布過濾，準(zhǔn)確量取25.0mL濾液于50mL離心管中，5 000r／min離心30min，上清液用濾紙過濾，濾液過0.22μm濾膜后進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生化條件的選擇

2.1.1 衍生劑1中次氯酸鈉對(duì)衍生效率的影響

衍生劑1是由氯化鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、次氯酸鈉組成的體系，該體系的pH＝12。在同一個(gè)草甘膦濃度下，設(shè)定5%次氯酸鈉的7個(gè)添加量，在1 000mLGA116中，分別添加40、60、80、100、120、140、160μL進(jìn)行測(cè)定（圖2）?？梢钥闯?，次氯酸鈉的量影響衍生效果。當(dāng)添加量小于80μL時(shí)，隨著次氯酸鈉添加量的增加，響應(yīng)值逐漸增大；當(dāng)大于80μL時(shí)，隨著次氯酸鈉添加量的增加響應(yīng)值基本不發(fā)生變化。因此選取100μL作為后繼試驗(yàn)的添加量。

圖2 次氯酸鈉量的選擇

2.1.2 衍生劑2中OPA、硼酸鉀對(duì)衍生效果的影響

衍生劑2由硼酸鉀、鄰苯二甲醛（OPA）、巰基乙醇的體系組成。固定鄰苯二甲醛、巰基乙醇的量，改變反應(yīng)緩沖液中硼酸鉀的鹽濃度，向1 000mL溶液中分別添加20、30、40、60、80、100、130g硼酸鉀進(jìn)行測(cè)定（圖3）。草甘膦濃度相同時(shí)，隨著硼酸鉀添加量的增加，響應(yīng)值逐漸增大；添加量為130g／L時(shí)，硼酸鉀在水中達(dá)到了飽和，此時(shí)響應(yīng)值最大。因此選取130g／L作為后繼試驗(yàn)的添加量，此時(shí)溶液的pH＝9.8。

圖3 硼酸鉀濃度的選擇

OPA添加量的設(shè)置：在GA104分別添加40、60、80、100、200、250、300mg OPA進(jìn)行測(cè)定（圖4）?？梢钥闯?，草甘膦濃度相同時(shí)，OPA添加量的多少影響衍生效果，OPA添加量高于80mg后，響應(yīng)值開始趨于平穩(wěn)，因此選擇100mg／950mL作為添加量。

以上試驗(yàn)結(jié)果表明，草甘膦衍生反應(yīng)效率受多個(gè)因素的影響，本試驗(yàn)所涉及的因子中，流動(dòng)相的組成百分比及pH，次氯酸鈉和硼酸鉀等的反應(yīng)量均與衍生效率密切相關(guān)。

圖4 鄰苯二甲醛濃度的選擇

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制草甘膦標(biāo)準(zhǔn)液濃度為 0.05、0.1、0.5、1.0mg／L和2.0mg／L；以峰面積定量y對(duì)濃度x（mg／L）進(jìn)行回歸分析，草甘膦的回歸方程為y＝36.464x＋0.221 1，相關(guān)系數(shù)R2＝0.999 9。

2.3 方法的準(zhǔn)確度、靈敏度和精密度

方法的準(zhǔn)確度可用添加回收率表示。在農(nóng)田溝渠水中設(shè)置3個(gè)添加水平：0.05、0.1、1mg／L。每個(gè)添加水平平行測(cè)定5次，平均回收率98.2%～104.4%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）2.1%～3.6%（表2）。以農(nóng)田溝渠水的最低添加量作為檢出限0.05mg／L。達(dá)到農(nóng)藥殘留分析對(duì)靈敏度的要求。農(nóng)田溝渠水的空白和添加草甘膦樣品譜圖見圖5。由圖5可知，0.05mg／L和1mg／L草甘膦分別在農(nóng)田溝渠水中的添加回收率的峰形較好。

表2 農(nóng)田溝渠水草甘膦的添加回收率

圖5 空白樣品和草甘膦加標(biāo)樣品色譜圖

3 結(jié)論與討論

本文確立了農(nóng)田溝渠水中草甘膦的高效液相色譜柱后衍生檢測(cè)方法。草甘膦在0.05～2mg／L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，添加水平為0.05～1mg／L的平均回收率為98.2%～104.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～3.6%，方法檢出限為0.05mg／L。中國(guó)草甘膦 MRL值為0.5～1mg／L，本方法能滿足農(nóng)田溝渠水中草甘膦的殘留量檢測(cè)。

試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，使用不同批次配制的流動(dòng)相，草甘膦的保留時(shí)間會(huì)略有變化，但對(duì)測(cè)定結(jié)果不產(chǎn)生影響。根據(jù)柱后衍生原理，甘氨酸可能對(duì)草甘膦測(cè)定產(chǎn)生干擾，因此采用本文建立的方法對(duì)甘氨酸進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，本試驗(yàn)中甘氨酸對(duì)草甘膦的測(cè)定不產(chǎn)生干擾作用。

高效液相色譜柱后衍生法檢測(cè)草甘膦是通過色譜柱將草甘膦與雜質(zhì)分離，柱后衍生系統(tǒng)將其在線衍生為異吲哚物質(zhì)，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，靈敏度高。農(nóng)田溝渠水經(jīng)過沉淀過濾即可直接進(jìn)樣檢測(cè)，處理方法簡(jiǎn)單。結(jié)合自動(dòng)進(jìn)樣器能大批量自動(dòng)衍生檢測(cè)樣品，省工省時(shí)。同時(shí)在線衍生避免了柱前人工衍生造成的誤差，精密度高。常規(guī)柱前衍生反應(yīng)需控制在一定時(shí)間內(nèi)，不易大批量衍生樣品，并且柱前衍生應(yīng)用的衍生試劑鄰硝基苯磺酰氯、二硝基氟苯等毒性大，在開放環(huán)境的操作過程對(duì)人體危害大［10，18］。而柱后衍生試劑是封閉系統(tǒng)中在線自動(dòng)完成，對(duì)人體危害小。

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Determination of glyphosate in the water of farmland ditch by high performance liquid chromatography－post column derivation

Wang Cong1， Liu Yingchao1， Pang Minhao1， Dong Jingao2
（1.CollegeofPlantProtection，AgriculturalUniversityofHebei，Baoding071000，China；2.MycotoxinandMolecularPlantPathologyLaboratory，AgriculturalUniversityofHebei，Baoding071000，China）

In order to accurately evaluate the bio－environmental safety of glyphosate，a HPLC－post column derivation method was developed to determine glyphosate in the water of farmland ditch.Glyphosate in the water of farmland ditch was derivatized with the sodium hypochlorite，o－phthalic aldehyde and mercaptoetha－nol，which were detected withfluorescence detector.The 5%sodium hypochlorite volume of derivative 1 was 100μL／L；potassium borate and OPA volumes of derivative 2 were 130 g／L and100 mg／950 mL，respectively.The linearities of glyphosate were at the concentration range of 0.05 to 2.0mg／L，with a correlation coefficient of 0.999 9.The mean spiked recoveries of glyphosate at 3 spiked levels ranged from98.2%to 104.4%.The relative standard deviations（RSD，n＝5）were 2.1%－3.6%.The limit of detection was 0.05 mg／L.This method is sensitive，simple，rapid and suitable for determining glyphosate in the water of farmland ditch.

high performance liquid chromatography； post column derivation； the water of farmland ditch；glyphosate

TQ 450.263

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.019

2011－11－24

2011－12－26

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)基金（CARS－02）

＊ 通信作者E－mail：liuyingchao＠hebau.edu.cn，dongjingao＠126.com