顏 玲,周慶華

(1.湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院,恩施 445000;2.荊楚理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院,湖北荊州 434000)

目前認(rèn)為中樞神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制與神經(jīng)細(xì)胞凋亡、神經(jīng)遞質(zhì)紊亂、自由基損傷等有關(guān)[1]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)神經(jīng)細(xì)胞凋亡后的修復(fù)與再生較為復(fù)雜,現(xiàn)有資料認(rèn)為其再生是損傷或病變神經(jīng)元軸突沿?fù)p傷方向重新生長,之后予以重建突觸與功能聯(lián)系,而不是損傷或死亡神經(jīng)元的簡單被替換?，F(xiàn)大量研究表明,神經(jīng)軸突的生長特點(diǎn)是通過一種嘌呤敏感性機(jī)制予以控制的一個(gè)特征性的基因表達(dá)程序[2]。在成熟的CNS神經(jīng)元中,這種特征性的基因表達(dá)程序可以被再次激活而誘導(dǎo)軸突生長并予以延伸[3]。有研究報(bào)道,海馬顆粒細(xì)胞在短暫性腦缺血后,其神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(neural cell adhesion molecule,NCAM)的表達(dá)明顯增加[4]。這就間接說明,至少NCAM是促進(jìn)神經(jīng)結(jié)構(gòu)的重塑并刺激神經(jīng)生長的因子之一。黃芪多糖是從黃芪(astragalus,AG)中提取的活性化合物,其脂溶性好,易透過血腦屏障。具有抗氧化、延緩衰老、維護(hù)腦細(xì)胞代謝和免疫調(diào)節(jié)等多種作用[5]。為探究AG對(duì)中樞神經(jīng)的保護(hù)作用及機(jī)制,本研究采用AG干預(yù)大鼠缺血性腦損傷模型,研究AG對(duì)大腦和海馬神經(jīng)元修復(fù)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

動(dòng)物系經(jīng)過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)篩選合格的封閉群Wister雄性大鼠100只(體重180～220 g),購于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。黃芪多糖(Sigma Aldrich公司,S07477-286);NCAM單克隆抗體(Sigma Aldrich公司,1∶200);全自動(dòng)生化分析儀(美國思博名科學(xué)器材公司,TMS-1024i/Biolis);立體顯微鏡(日本,SZX6745-J4);多普勒血流探測儀(日本,ES-1000spm);原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒TUNEL(廣州博理生物科技有限公司,TBD2020POD);β-actin引物(批號(hào)20100651)和 c-fos引物(批號(hào) 20100618)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供;MK3型酶標(biāo)儀(芬蘭,00120F006001);單道可調(diào)加樣槍(德國Tripette);MG96G型PCR儀(YK0202023)杭州朗基科學(xué)儀器有限公司提供;LG2020D型凝膠成像分析系統(tǒng)、JY300+型電泳儀及JY-SCZ2型電泳槽由北京君意東方電泳設(shè)備有限公司提供;A1301026型低溫離心機(jī)上海艾測電子科技有限公司提供;美國DQ300型Hoefer核酸蛋白熒光定量分析儀(上海吉泰生物科技有限公司)。

1.2 動(dòng)物分組與給藥

將大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組(SOG),模型組(MG-1d,3d,7d)、低劑量黃芪多糖治療組(L-AGTG-1d,3d,7d)和高劑量黃芪多糖治療組(H-AGTG-1d,3d,7d),每組10只。L-AGTG和H-AGTG缺血2 h后分別每日2次ip AG 5 mg/kg和15 mg/kg(以生理鹽水稀釋成2 ml),直至處死取材。SOG與MG缺血2 h后分別每日2次注射等容量生理鹽水(ip)。

1.3 動(dòng)物處理[5]

動(dòng)物10%水合氯醛麻醉(300 mg/kg,ip),仰臥固定,右腹股溝切開暴露股動(dòng)脈插管備用。頸正中縱行切開約1～1.5 cm,逐層分離,暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈。MG、L-AGTG和H-AGTG組結(jié)扎并切斷頸外動(dòng)脈及分支,隨后沿頸內(nèi)動(dòng)脈根部結(jié)扎其顱外分支(翼腭動(dòng)脈),應(yīng)用Koizumi等[6]線栓法,由右頸外-頸內(nèi)動(dòng)脈插入絲線(5-0,頭端粘有硅膠,連續(xù)光滑,直徑0.21～0.27 mm),制造右大腦中動(dòng)脈阻塞(right middle cerebral artery occlusion,RMCAO)再灌注模型[5]。隨后沿著頸外動(dòng)脈殘端插入同樣絲線,沿頸外動(dòng)脈與頸總動(dòng)脈分叉處,輕輕向頸內(nèi)動(dòng)脈推進(jìn)至頸內(nèi)動(dòng)脈顱內(nèi)分叉處,進(jìn)線長度約(1.7±0.2)cm,使流入大腦中動(dòng)脈血流被阻斷。在MG、L-AGTG和H-AGTG組缺血2 h后,輕拔栓線至頸總動(dòng)脈,按文獻(xiàn)[6]要求,缺血性腦損傷組選擇再灌注時(shí)間點(diǎn)為1 d、3 d和7 d。SOG只暴露血管即縫合。術(shù)后室溫保持在25℃左右,維持肛溫(37±0.5)℃。除去術(shù)后死亡大鼠,經(jīng)NIPs評(píng)分最后得合符要求大鼠分別為:SOG 10只,MG和L-AGTG-1d,3d,7d各10,8,9只;H-AGTG-1d,3d,7d各8,9,8只。

1.4 神經(jīng)功能缺損評(píng)分(NIPs)

按Bederson等神經(jīng)功能缺損評(píng)分(neurologic impairment score,NIPs)法[4],在造模前和處死取材前評(píng)分。即:0分:無神經(jīng)功能缺失;1分:腦缺血的對(duì)側(cè)前肢出現(xiàn)屈曲;2分:自由活動(dòng)時(shí)不向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈,手推腦缺血的對(duì)側(cè)肩部時(shí),其肌抵抗力降低;3分:自由活動(dòng)時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈,手推腦缺血的對(duì)側(cè)肩部時(shí),其肌抵抗力降低。

1.5 病理學(xué)檢查與凋亡神經(jīng)元計(jì)數(shù)

于各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(1 d、3 d和 7 d)斷頭取腦,迅速將完整大腦置于生理鹽水培養(yǎng)皿中,剝離完整海馬,取一半海馬組織,浸于4%多聚甲醛固定,常規(guī)脫水 、透明 、浸蠟、包 埋 、切 片 、脫蠟 ,Bielschow-sky 染色,光鏡下觀察端腦皮質(zhì)及海馬各區(qū)的病理變化。另一半海馬組織從前端開始連續(xù)冠狀大腦切片和海馬CA1區(qū)切片各3張(厚2 mm),立即放入2%TTC液中,在恒溫37℃狀態(tài)下,避光染色,30 min后觀察切片。每張片每個(gè)部位取10個(gè)視野,在光學(xué)顯微鏡下觀察神經(jīng)元凋亡情況,用圖像分析儀統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡率(凋亡率=凋亡數(shù)/總數(shù)×100%)。

1.6 免疫組織化學(xué)研究

按文獻(xiàn)[6]用4%多聚甲醛將腦預(yù)固定12 h,放進(jìn)25%蔗糖溶液浸泡沉底后,剝離出完整的海馬。將海馬CA1區(qū)和大腦連續(xù)冠狀冰凍切出20μ m厚的切片。用0.3%H2O2甲醇處理大腦前囟1.2～1.6 mm間的切片(清除內(nèi)源性過氧化物酶),再浸入TritonX-100的PBS(濃度0.01 mol/L),用正常馬血清封閉0.5 h,防止非特異性IgG結(jié)合。用ABC法進(jìn)行免疫組化染色,單克隆抗體按1∶200 NCAM放入濕盒,于冰箱孵育 36 h(恒溫 4℃)后,用PBS沖洗 5 min,連續(xù)3次,用馬抗小鼠IgG(1∶200生物素結(jié)合)和過氧化物酶復(fù)合物(1∶100卵白素-生物素)孵育。當(dāng)顯色底物DAB(diaminobenzidine)呈色10 min后用水沖洗,蘇木素復(fù)染,梯度酒精脫水。Xylene(二甲苯)透明,GUM(中性樹膠)封片,鏡下觀察。

1.7 海馬組織總RNA提取與鑒定

按文獻(xiàn)[5]用RT-PCR法半定量分析海馬c-fos mRNA水平(用Trizol試劑提取海馬組織總RNA)。首先吸取60～80mg海馬組織,加入Trizol 1 ml,用勻漿器勻漿至液態(tài)。將勻漿置入1.5 ml離心管中,于25℃靜置3 min后,4 000 r/min(4℃,離心力12 000×g)離心10 min,吸取上清液放入新的離心管,去除不溶組織沉淀。向上清液中加入氯仿200 μ l,顛倒混勻15 s,于25℃靜置3 min,按上述操作繼續(xù)離心15 min。小心吸取上清液,加入到另一離心管中,加入異丙醇500 μ l,搖勻。于25℃靜置10 min后,按上述操作繼續(xù)離心10 min,去除上清液,以1 ml 75%乙醇洗滌RNA沉淀,混勻后,以4℃離心力7 500×g離心5 min,去除上清液,于25℃干燥,沉淀RNA 5～10 min,用DEPC(二乙基焦磷酰胺)處理過的50 μ l無菌水溶解 RNA,55℃水浴助溶10 min。取 5 μ l進(jìn)行瓊脂糖甲醛變性膠電泳鑒定,再取5 μ l加入DEPC處理的45 μ l無菌水,用核酸蛋白熒光定量分析儀測定RNA含量,余下的RNA液存于-85℃冰箱備用。

1.8 c-fos基因的擴(kuò)增

反轉(zhuǎn)錄在20 μ l反應(yīng)體積中進(jìn)行。按文獻(xiàn)[7]用AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μ l(10 U/μ l),dNTP2 μ l(10 mmol/L),Rnasin 0.7 μ l(30 U/μ l),于 42℃和 95℃中分別變性45 min和5 min。PCR反應(yīng)體系于 50 μ l中進(jìn)行。其方法為:c-fos mRNA于 94℃、62℃、72℃和 55℃中分別延伸 45 s、45 s、1 min 以及 5 min。β-actin mRNA于94℃、58℃、72℃和55℃中分別延伸1 min、1 min、1 min以及5 min延伸。共循環(huán)30次。β-actin的PCR產(chǎn)物長度為200 bp,β-actin上游引物為5'-TCG AAT GGC TCC TAC ATT3',β-actin下游引物為 5'-AGG TCA ACC AGA ACG GCA3'。c-fos基因的PCR產(chǎn)物長度為400 bp,c-fos基因上游引物為5'-ACG GCA CTT TAT ATT GAC3',c-fos基因下游引物為5'-TCC GGC TAT TAA AAT GAT3'。

1.9 圖像與數(shù)據(jù)處理

用CMIAS-008型(航空航天大學(xué)醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng))檢測NCAM陽性細(xì)胞吸光度。各數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 AG對(duì)腦缺血/再灌注大鼠NIPs和海馬 CA1區(qū)NCAM表達(dá)的影響

隨時(shí)間延長,各組NIPs顯著減少。L-AGTG和H-AGTG的NIPs明顯少于MG,H-AGTG又少于LAGTG(P＜0.05或P＜0.01)。海馬神經(jīng)元NCAM的表達(dá)隨時(shí)間變化出現(xiàn)明顯差異,其差異順序?yàn)?SOG＜MG＜L-AGTG＜H-AGTG(P＜0.05或P＜0.01),有劑量依賴趨勢(表1,圖1見彩圖頁Ⅵ)。

Tab.1 Effects of AG on the NIPs and expression of the NCAM of hippocampus CA1 region after the RMCAO in rats(±s)

Tab.1 Effects of AG on the NIPs and expression of the NCAM of hippocampus CA1 region after the RMCAO in rats(±s)

AG:Astragalan;NIPs:Neurologic impairment score;NCAM:Neural cell adhesion molecule;RMCAO:Right middle cerebral artery occlusion;SOG:Sham operated group;MG:Model group;L/H-AGTG:Low and high dose astragalan treatment groups*P＜0.05,**P＜0.01 vs MG;#P＜0.05,##P＜0.01 vs itself 1 d or 3 d;△P ＜0.05,△△P＜0.01 vs L-AGTG at the same time segmental

Group n NIPs Expression of NCAM SOG 10 0 0.143±0.011 MG 1 d 102.19±0.13 0.156±0.012 3 d 8 2.92±0.14# 0.191±0.014#7 d 92.59±0.11# 0.193±0.018##L-AGTG 1 d 102.41±0.09* 0.142±0.013*(5 mg/kg)3 d 81.41±0.08*##0.212±0.021*##7 d 91.08±0.16*##0.226±0.028**##H-AGTG 1 d 8 2.01±0.19** 0.188±0.027**△△(15 mg/kg)3 d 9 1.13±0.13*##0.268±0.022**##△△7 d 80.22±0.06**##0.281±0.023**##△△

2.2 大鼠海馬CA1區(qū)病理觀察與神經(jīng)元凋亡情況

SOG未發(fā)現(xiàn)明顯病理改變,神經(jīng)原纖維排列有序、稀疏,無神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFT),海馬錐體神經(jīng)元呈錐形,外形規(guī)則,細(xì)胞膜完整,見較大頂樹突,細(xì)胞核多為圓形或橢圓形,核染色質(zhì)均勻清晰;MG神經(jīng)原纖維密集、排列紊亂,部分融合,凝集成寬帶狀,銀染加深,可見大量NFT,錐體細(xì)胞胞漿輕度腫脹,細(xì)胞核固縮,核染色質(zhì)濃縮,核膜不清;L-AGTG-7d神經(jīng)原纖維排列部分紊亂,部分密集,可見少許NFT;H-AGTG-7d神經(jīng)元纖維排列有序,密集程度緩解,未見NFT。SOG神經(jīng)元凋亡不明顯,其他各組隨時(shí)間推移,神經(jīng)元凋亡明顯增多(P＜0.05),在同一時(shí)間,凋亡神經(jīng)元有顯著差異,SOG＜L-AGTG＜H-AGTG＜MG(P＜0.05或P＜0.01,表2,圖2見彩圖頁Ⅵ)。

2.3 腦缺血/再灌注大鼠海馬CA1區(qū)β-actin與cfos mRNA電泳結(jié)果

各圖泳道排列為從左至右依次是SOG、MG-7d、L-AGTG-7d、H-AGTG-7d及 DNA marker。海馬 RNA甲醛瓊脂糖變性膠電泳為三條帶,即28S、18S和5S,前兩條熒光信號(hào)較強(qiáng),后一條帶熒光信號(hào)較弱。RNA光吸收值分別為A250和270,比值為0.926,提示RNA的純度可靠(圖3)。c-fos mRNA電泳條帶結(jié)果表明,L-AGTG-7d與H-AGTG-7d熒光信號(hào)顯著強(qiáng)于SOG和MG,而且H-AGTG-7d強(qiáng)于L-AGTG-7d(圖3)。提示AG能顯著促進(jìn)c-fos mRNA的表達(dá)。

Tab.2 Effects of AG on the apoptosis population of hippocampus CA1 region after the RMCAO in rats(±s)

Tab.2 Effects of AG on the apoptosis population of hippocampus CA1 region after the RMCAO in rats(±s)

AG:Astragalan;RMCAO:Right middle cerebral artery occlusion;SOG:Sham operated group;MG:Model group;L/HAGTG:Low and high dose astragalan treatment groups*P＜0.05,**P＜0.01 vs MG at the same time segmental;#P＜0.05 vs itself 1 d or 3 d;△P＜0.05 vs L-AGTG at the same time segmental

Group n Apoptosis population SOG 10 3.56±1.08 MG 1 d 10 43.47±4.32 3 d 8 51.19±3.67 7 d 9 57.12±6.02#L-AGTG 1 d 10 37.14±5.09(5 mg/kg) 3 d 8 41.34±4.62*7 d 9 43.48±6.48**H-AGTG 1 d 8 30.82±4.61**(15 mg/kg) 3 d 9 33.61±3.75**△7 d 8 35.19±5.84**△

Fig.3 Expression straps of hippocampus mRNA

2.4 大鼠海馬內(nèi)c-fos基因表達(dá)RT-PCR半定量測定

結(jié)果表明,MG腦缺血/再灌注后,隨時(shí)間的推移,海馬c-fos灰度值/β-actin灰度值逐漸增加;LAGTG海馬c-fos灰度值/β-actin灰度值增加顯著強(qiáng)于MG而弱于H-AGTG(P＜0.05或P＜0.01,表3)。

3 討論

腦缺血首先導(dǎo)致腦急性能量代謝障礙,使得神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外離子平衡失調(diào),細(xì)胞內(nèi)積聚大量鈉鈣,導(dǎo)致細(xì)胞水腫,甚至破裂[8]。其中,海馬神經(jīng)元對(duì)缺血缺氧性損害極其敏感,特別是CA1區(qū)[9]。而海馬又是學(xué)習(xí)記憶的高級(jí)中樞,老年性癡呆就與海馬退行性病變相關(guān)[10]。缺血損傷消除后,損傷的神經(jīng)元就會(huì)逐漸修復(fù),其修復(fù)的本質(zhì)就是神經(jīng)元的再發(fā)育過程,這種發(fā)育過程必然伴隨相關(guān)物質(zhì)的表達(dá)[7]。神經(jīng)元表面有一種具有介導(dǎo)細(xì)胞黏附與識(shí)別,并能加速神經(jīng)元的修復(fù)與再生的糖蛋白,這種糖蛋白就是NCAM[6]。故此,研究NCAM 的表達(dá),能夠促使人們更深層次的認(rèn)識(shí)神經(jīng)元及神經(jīng)纖維再生的機(jī)制[9]。本研究發(fā)現(xiàn)AG能顯著減少缺血性腦損傷再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分,改善損傷大鼠神經(jīng)功能,其作用機(jī)制可能是:

Tab.3 Effects of AG on the c-fos-grayscale/β-actin-grayscale of the hippocampus CA1 region after the reperfusion rats in cerebral ischemia(±s)

Tab.3 Effects of AG on the c-fos-grayscale/β-actin-grayscale of the hippocampus CA1 region after the reperfusion rats in cerebral ischemia(±s)

AG:Astragalan;SOG:Sham operated group;MG:Model group;L/H-AGTG:Low and high dose astragalan treatment groups*P＜0.05,**P＜0.01 vs MG or L-AGTG at the same time segmental;#P＜0.05,##P＜0.01 vs itself 1 d or 3 d

Group n c-fos/β-actin SOG 10 0.23±0.09 MG 1 d 10 0.28±0.12 3 d 8 0.32±0.11#7 d 9 0.48±0.14##L-AGTG 1 d 10 0.24±0.08(5 mg/kg) 3 d 8 0.41±0.13*##7 d 9 0.53±0.13*##H-AGTG 1 d 8 0.25±0.16(15mg/kg) 3 d 9 0.47±0.10*##7 d 8 0.61±0.14**##

3.1 上調(diào)海馬NCAM的表達(dá),減輕神經(jīng)元凋亡而減輕神經(jīng)功能缺損

有研究證實(shí),成年后NCAM只存在于嗅神經(jīng)和有生理性塑形區(qū)[8]。NCAM是單鏈跨膜免疫球蛋白,其特征是含有α-2,8鍵相連多聚唾液酸糖鏈(polysialylate,PSA)[9]。PSA可直接或間接地調(diào)節(jié)細(xì)胞之間的粘附功能[6],這種粘附性依賴于其本身的拼接方式和糖化狀態(tài),還依賴于其周圍神經(jīng)元、細(xì)胞外基質(zhì)和膠質(zhì)細(xì)胞中的配體表達(dá)[7]。NCAM在膠質(zhì)細(xì)胞和雪旺細(xì)胞中表達(dá)后,形成神經(jīng)元生長通道[9]。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell,NSC)的發(fā)育到達(dá)遷移階段時(shí),NCAM的高度表達(dá),就促成了神經(jīng)軸突的生長、突觸塑形和拼接,同時(shí)加速神經(jīng)元環(huán)路的形成和NSC的遷移。有研究表明,NCAM的表達(dá)就是神經(jīng)干細(xì)胞遷移的標(biāo)志[8]。本研究表明,大鼠腦缺血/再灌注24 h后,在神經(jīng)功能開始恢復(fù)的同時(shí),NCAM的表達(dá)逐漸增強(qiáng),符合神經(jīng)功能恢復(fù)的規(guī)律[7]。提示神經(jīng)軸突再生和突觸重建與NCAM存在著密切關(guān)聯(lián),至少能說明NCAM的高表達(dá)是促進(jìn)腦缺血損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的促進(jìn)因素之一[6]。本研究表明,AG能呈劑量依賴性增強(qiáng)大鼠腦缺血/再灌注損傷后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元NCAM的表達(dá)。病理觀察也發(fā)現(xiàn),AG能顯著減輕大鼠腦缺血/再灌注損傷后海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞腫脹,增加錐體細(xì)胞頂樹突和正常神經(jīng)元數(shù)量,顯著減少NFT。明顯減少神經(jīng)元凋亡數(shù)量,表明AG對(duì)海馬神經(jīng)元病理改變具有阻滯和部分逆轉(zhuǎn)作用,其機(jī)制可能與NCAM的高度表達(dá)直接相關(guān)。海馬與人類學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān),因此,本研究為AG在老年性癡呆和其他神經(jīng)功能損傷性疾病的防治中顯示出良好的應(yīng)用前景。

3.2 上調(diào)海馬c-fos基因的表達(dá),加快下游基因的表達(dá),保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞而減輕神經(jīng)功能缺損

腦缺血損傷消除后,受到損傷神經(jīng)元會(huì)逐漸修復(fù),其修復(fù)再生過程必然伴隨相關(guān)物質(zhì)表達(dá)[10]。有研究報(bào)道,對(duì)記憶力具有雙向影響作用的c-fos mRNA在一定范圍內(nèi)的表達(dá),能改善學(xué)習(xí)記憶力[4]。cfos早期在腦中參與神經(jīng)元信號(hào)的整合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、分析與凋亡,與學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知功能相關(guān)[5]。其中低水平的c-fos表達(dá),可能直接參與了神經(jīng)元的分化、生長、學(xué)習(xí)記憶以及神經(jīng)突觸的可塑性變化等多種生理過程[9]。其機(jī)制是c-fos基因影響轉(zhuǎn)錄和翻譯控制下游靶基因轉(zhuǎn)錄,從而合成新蛋白質(zhì),影響學(xué)習(xí)記憶編碼有利于學(xué)習(xí)記憶[8]。有研究報(bào)道,單純腦缺血/再灌注,海馬CA1區(qū)c-fos原癌基因產(chǎn)物Fos有較高的表達(dá),能促進(jìn)損傷神經(jīng)元的再生與重塑,加速缺血損傷后神經(jīng)元的修復(fù)[10]。表明誘導(dǎo)腦內(nèi)c-fos基因表達(dá),能增強(qiáng)人腦學(xué)習(xí)記憶。本研究發(fā)現(xiàn),使用AG治療大鼠的海馬CA1區(qū)神經(jīng)原纖維病變較模型組明顯減輕,神經(jīng)原纖維隨劑量增加和時(shí)間推移逐漸排列有序,密集程度明顯緩解,NFT最后消失,正常神經(jīng)元數(shù)量明顯多于模型組(P＜0.05或P＜0.01)。表明AG呈劑量依賴趨勢的部分逆轉(zhuǎn)海馬神經(jīng)元病理改變。研究還發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組海馬的c-fos mRNA表達(dá)顯著低于模型組(P＜0.05或P＜0.01),c-fos灰度值/β-actin灰度值也增加。表明腦缺血因素導(dǎo)致海馬c-fos表達(dá)增強(qiáng),通過促進(jìn)下游基因表達(dá)而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。AG治療組海馬c-fos表達(dá)均高于模型組(P＜0.05或P＜0.01),且c-fos灰度值/β-actin灰度值增加顯著強(qiáng)于模型組(P＜0.05或P＜0.01)。表明,AG可上調(diào)c-fos mRNA表達(dá)。由此推論,AG減少損傷神經(jīng)功能評(píng)分,改善腦功能狀態(tài),部分逆轉(zhuǎn)海馬神經(jīng)元病理改變,至少與其加速cfos基因的表達(dá)相關(guān)[8]。

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