譚曉秋,陳桂蘭,李 濤,毛 亮,井上勛,楊 艷,曾曉榮

(瀘州醫(yī)學院醫(yī)學電生理省部共建教育部重點實驗室,四川瀘州 646000)

近年來,小電導鈣激活鉀通道(small conductance calcium activated potassium channels,SK2)在人心房肌細胞上發(fā)現(xiàn)并證明在心肌細胞復極化過程中扮演著重要角色[1]。SK2通道在心房與心室表達的不均一性以及與胞內鈣離子和細胞膜鈣通道的耦聯(lián)關系提示在某些房性心律失常(如心房顫動等)發(fā)生發(fā)展中起重要作用,也可能成為這些疾病的治療靶點[2-4]。異源表達離子通道在工具細胞如HEK293等,已成為目前研究離子通道功能活動和藥物篩選的主要方法之一。因直接進行RT-PCR無法得到該基因(KCNN2)的編碼區(qū)全長序列,本研究旨在采用Overlapping PCR(重疊PCR)法進行KCNN2基因全長序列的擴增和表達質粒的構建。

1 材料與方法

1.1 實驗標本、試劑和儀器

用于本研究的實驗標本來源于一例先天性心臟病患者體外循環(huán)手術常規(guī)切除的右心耳組織。主要試劑包括總RNA提取試劑盒(上海華舜公司)、逆轉錄試劑盒與SYBR Green I定量試劑盒(TOYOBO公司)、膠回收試劑盒(北京天根公司)、質粒提取試劑盒、pMD18-T載體、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)、5-溴-4 氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-a-D-galactopyranoside,X-gal,TAKARA公司),焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate,DEPC)、LB培養(yǎng)基(上海生工公司),大腸桿菌DH5α本實驗室自己保存,其余試劑為國產(chǎn)分析純。主要實驗儀器有實時熒光定量PCR儀(MJ公司)、紫外分光光度儀(Nanodrop公司)、超速低溫離心機(Heraeus公司)、Millipore超純水儀(Millipore公司)等。

1.2 總RNA提取和逆轉錄

進行人心房肌總 RNA提取,得到的總 RNA-80℃保存?zhèn)溆?。取總RNA約1.5 μ g,構建逆轉錄反應體系 :Total RNA 1.5 μ g 、ReverTra Ace 1 μ l、5 ×RT Buffer 4 μ l、dNTP Mixture 2 μ l、RNase Inhibitor 1 μ l、Random Primer 1 μ l、RNase Free H2O up to 20 μ l。獲得的cDNA-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Overlapping法擴增SK2編碼區(qū)全長

采用Overlapping PCR方法(引物見表1,方法見圖1)進行PCR擴增,得到小電導鈣激活鉀通道編碼基因KCNN2編碼區(qū)全長。首先以cDNA為模板,分別使用三對不同的引物,根據(jù)其自身的條件進行PCR,擴增得到三個不同的KCNN2基因片段,長度分別為775 bp,691 bp,715 bp。然后將含有三個不同片段的DNA作為模板,使用擴增第一個片段的上游引物和擴增第三個片段的下游引物,作為反應的引物進行PCR擴增,產(chǎn)物經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳和膠回收,得到KCNN2基因編碼區(qū)的全長序列。為保證終止效果,在第三段擴增的過程中,我們在原有終止子UAG的基礎上再增加一個終止子UAG。

1.4 表達質粒pIRES-hrGFP-SK2的構建

將擴增得到的KCNN2基因編碼區(qū)的全長序列通過T-A克隆的與克隆載體pMD18-T Vector進行連接和轉化反應。在含有X-gal、IPTG、Amp的 L-瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng),形成單菌落。進行藍白篩選,提取陽性菌落質粒,得到的重組質粒標準品經(jīng)PCR法和酶切法鑒定。

由于得到的KCNN2基因全長和表達質粒pIRES-hrGFP均含有Bam HI和Eco RI限制性內切酶位點,并且方向一致,不會影響KCNN2基因的表達。將含有KCNN2基因全長序列的克隆載體pMD18-T Vector與表達質粒pIRES-hrGFP進行分別的雙酶切反應并進行1%的瓊脂糖凝膠電泳和膠回收,選擇KCNN2基因全長片段和表達質粒pIRES-hrGFP片段進行T4連接反應,將連接產(chǎn)物轉化到感受態(tài)細菌DH5α中,提取質粒,通過酶切法和測序法鑒定表達質粒pIRES-hrGFP-SK2,選取序列正確的質粒和菌液保存?zhèn)溆谩?/p>

Tab.1 Primer of gene KCNN2 for Overlapping PCR

Fig.1 Schematic diagram of Overlapping PCR for amplifying the full-length of KCNN2

2 結果

2.1 Overlapping PCR結果

以cDNA為模板,分段擴增KCNN2基因的電泳結果如圖2A所示,三個片段的位置與預測值基本一致。目的條帶單一清晰,且沒有明顯拖尾和引物二聚體產(chǎn)生。

在此基礎上,以三個目的片段的混合DNA為模板,以第一對引物的上游和第三對引物的下游作為引物進行Overlapping PCR擴增,得到的產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳如圖2B所示,可見一比1500 bp略大的清晰單一條帶,我們推測是KCNN2基因全長,這在后續(xù)實驗中得到了證實。

2.2 表達質粒pIRES-hrGFP-SK2酶切鑒定和序列分析

將構建的表達質粒pIRES-hrGFP-SK2經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切反應并經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳,結果如圖3所示。可見兩條單一的電泳條帶,其中分子量較小的條帶位置與KCNN2基因全長大小基本一致,分子量較大的條帶則為經(jīng)過雙酶切之后的表達質粒pIRES-hrGFP片段。

將得到的表達質粒經(jīng)測序,結果如圖4所示與Genebank數(shù)據(jù)庫人心肌KCNN2基因相比較,第531位氨基酸由精氨酸(CGG)變成了谷氨酰胺(CAG)。但是這一位點與腦中KCNN2基因序列一致。但與腦中KCNN2序列相比,腦組織中整個KCNN2基因全長序列為1740 bp,51至59九個丙氨酸殘基位置在腦中僅有8個丙氨酸殘基,比心肌KCNN2基因正好少三個堿基。

Fig.2 Electrophotogram of Overlapping PCR amplifier

Fig.3 Electrophotogram of the expression plasmid pIRES-hrGFPSK2 cutted by the enzymes Bam HI and Eco RI

3 討論

3.1 Overlapping PCR的原理和應用

Fig.4 Sequencing results of the plasmid pIRES-hrGFP-SK2

Overlapping PCR(重疊PCR)技術是采用具有互補末端的引物,使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈,從而在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸,將不同來源的擴增片段連接起來,在體外進行有效的重組,而且不需要內切酶消化和連接酶處理。目前重疊PCR應用十分廣泛[5]。而對于長片段基因擴增,多利用cDNA文庫,限制性酶切位點,降落PCR,5'或3'末端PCR等方法,但這些方法具有PCR條件難以摸索、不易找到合適酶切位點和cDNA文庫昂貴的缺點。因此,本研究探討分段擴增重疊PCR的方法進行。

重疊PCR能成功的關鍵是重疊的部分能保證有效的退火。所以重疊的部分要有一定長度,并且注意這部分的GC含量,以便使這部分有一個合適的Tm值。本實驗中,兩個重疊片段的GC含量分別為49.1%和44.9%。

3.2 Overlapping PCR在本研究中的應用和序列分析

本研究采用重疊PCR的原因在于目的基因片段較長(1743 bp)和表達量相對較低,曾試圖使用一步法PCR和降落PCR,但是通過多次摸索實驗條件,均無法得到該目的基因的全長序列。再則,由于需要得到目的基因編碼區(qū)全長,因此引物設計上極易受到限制,無法得到較好的引物對。于是通過分段擴增的方法,一方面,PCR片段減小,擴增更為容易;另外一個重要的原因就是與直接擴增相比,引物設計的自由度更大。結果表明,該方法較為容易的得到了SK2通道基因編碼區(qū)全長序列,成功構建SK2通道基因表達質粒,為進一步研究SK2通道特性及其調控鑒定了基礎。由于要進行多次PCR,因此,為保證反應的保真性,我們采取使用高保真的DNA反應聚合酶和減少PCR反應的循環(huán)數(shù)(20～25循環(huán))。

在得到的質粒測序鑒定過程中,我們發(fā)現(xiàn),58位氨基酸堿基序列和531位氨基酸堿基序列表現(xiàn)出不同的特點。其中58位氨基酸在人腦組織中的氨基酸序列中并不存在,但是與已報道的人心房肌組織的氨基酸和堿基序列一致,也就是說編碼人腦組織中的SK2通道為579個氨基酸殘基(1740 bp),而心肌組織為580個氨基酸殘基(1743 bp)[1]。然而,在531位氨基酸上,我們的測序結果與腦組織的序列一致,為谷氨酰胺(CAG),文獻報道的心肌組織該位點則為精氨酸殘基(CGG)。究其原因主要有以下幾種可能:首先,SK2通道存在不同的剪變體,在心肌組織中存在文獻報道的心肌組織和腦組織的不同剪變體形式,由于我們采用分段擴增的方法,可能將兩個不同剪變體擴增而產(chǎn)生,或者是人心肌組織中就存在這種剪變體;其次,由于我們的實驗標本是來源一個病例標本,所以這也有可能是由于這個病例的個性產(chǎn)生的,由于離子通道高度的保守型,因而發(fā)生變異的可能性較小,但不能排除;再次,PCR擴增反應中突變產(chǎn)生,由于我們采用高保真的PCR反應酶,同時進行重復測序,因此這種可能性相對較少。由于這兩個位點處于通道的兩端,并非構成離子通道的主要功能單位,對通道結構功能影響很小,這在后續(xù)的離子通道電流檢測中得到了證實。因此,本實驗得到的SK2通道基因表達質粒可以用于進一步的功能調控實驗研究。

[1]Xu Y,Tuteja D,Zhang Z,et al.Molecular identification and functional roles of a Ca2+-activated K+channel in human and mouse hearts[J].J Biol Chem,2003,278(49):49085-49094.

[2]Tuteja D,Xu D,Timofeyev V,et al.Differential expression of small-conductance Ca2+-activated K+channels SK1,SK2,and SK3 in mouse atrial and ventricular myocytes[J].AmJ Physiol Heart Circ Physiol,2005,289(6):H2714-2723.

[3]Li N,Timofeyev V,Tuteja D,et al.Ablation of a Ca2+-activated K+channel(SK2 channel)results in action potential prolongation in atrial myocytes and atrial fibrillation[J].J Physiol,2009,587(pt 5):1087-1100.

[4]Lu L,Zhang Q,Timofeyev V,et al.Molecular coupling of a Ca2+-activated K+channel to L-type Ca2+channelsviaalpha-actinin2[J].Circ Res,2007,100(1):112-120.

[5]戴 燦,苗聰秀,盧光王秀.基于重疊延伸PCR法的定點突變技術[J].現(xiàn)代生物學醫(yī)學進展,2010,10(3):411-412.