洪富源,孫 芳,劉 軍,姚 建,黃一新

(1.福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床學(xué)院,福建省立醫(yī)院腎內(nèi)科,福州 350001;2.上海市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科,上海 200080)

腹膜病理研究發(fā)現(xiàn),長期腹膜透析后,腹膜間皮細(xì)胞下致密膠原層進(jìn)行性增厚,有相當(dāng)多的證據(jù)表明長期腹膜透析后腹膜的這些改變和腹透液的生物不相容性有關(guān),而緩沖液的組成、糖、糖降解產(chǎn)物是腹透液生物相容性最關(guān)鍵性的因素[1]。長期腹膜透析后患者腹膜長期暴露在含有高糖及含有葡萄糖降解產(chǎn)物的腹透液中,導(dǎo)致晚期糖基化終末產(chǎn)物(advancedglycosylation end products,AGEs)的積聚,這意味著腹膜長期受到AGEs的作用。有研究發(fā)現(xiàn)腹膜基質(zhì)的主要組成成分層連蛋白的表達(dá)水平與AGEs的沉積呈明顯正相關(guān),轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等促纖維化細(xì)胞因子在腹膜上的表達(dá)與AGEs的表達(dá)強(qiáng)度一致[2]。AGEs是否能夠促進(jìn)腹膜間皮細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì),是否參與長期腹透的腹膜纖維化過程目前尚不清楚。

本研究中我們采用體外人腹膜間皮細(xì)胞(human peritoneal mesothelial cells,HPMC)培養(yǎng)模型,觀察晚期糖基化人血清白蛋白(AGE-HSA)對HPMC合成纖維連接蛋白(FN)和PKC活性的影響。并且應(yīng)用PKC激動(dòng)劑PMA和PKC特異抑制劑Calphostin C進(jìn)行干預(yù),探討PKC信號通路在AGEs促進(jìn)人腹膜間皮細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人血清白蛋白(human serum albumin,HSA,AMRESCO產(chǎn)品),D-葡萄糖(Sigma公司),DMEM、HEPES(GIBCO公司),小牛血清(上海普飛生物公司),佛波脂(PMA,Sigma公司),Calphostin C(Sigma公司),非放射性PKC測定試劑盒(日本MBL公司),纖維連接蛋白(FN)酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒(上海太陽生物技術(shù)公司),Trizol(Invitrogen公司),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司),dNTP(脫氧核苷酸)、Taq DNA聚合酶(Promega公司),FN、GAPDH引物(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司),SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(大連寶生物TAKARA公司)。

1.2 AGE-HSA的制備

參照文獻(xiàn)[3],將1.75 g/L純化的HSA置于含或不含0.1 mol/L D-葡萄糖的0.4 mol/L磷酸鹽緩沖液中,37℃孵育8周。用pH 7.4磷酸鹽緩沖液透析以除去未結(jié)合的葡萄糖。以在同樣條件但不含葡萄糖的磷酸鹽緩沖液中孵育8周的HSA作為對照。體外制備的AGE-HSA經(jīng)熒光分光光度法鑒定。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人腹膜間皮細(xì)胞株(HMrSV5)由TENON醫(yī)院(法國)腎臟科腎臟病研究所Pierre RONCO教授饋贈(zèng)。細(xì)胞生長于DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清,2 mmol/L的 L-谷氨酰胺)中,5%CO2、37℃條件下培養(yǎng),常規(guī)換液。以第10～11代細(xì)胞作本試驗(yàn)。待細(xì)胞生長至70%～80%用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

A:對照組 HSA 500 μ g/ml;B:AGE-HSA 0 μ g/ml;C:AGE-HSA 100 μ g/ml;D:AGE-HSA 500 μ g/ml;E:AGE-HSA 1 000 μ g/ml;F:PMA 80 nmol/L;G:PMA 100 nmol/L孵育細(xì)胞 24 h后 +HSA 500 μ g/ml;H:PMA 100 nmol/L孵育細(xì)胞24 h后+AGE-HSA 500 μ g/ml;I:PMA 100 nmol/L孵育細(xì)胞24 h后+PMA 80 nmol/L;J:HSA 500 μ g/ml+calphostin C 100 nmol/L;K:AGE-HSA 500 μ g/ml+calphostin C 100 nmol/L;L:PMA 80 nmol/L+calphostin C 100 nmol/L。

1.5 HPMC細(xì)胞PKC活性測定

依照試劑盒說明進(jìn)行細(xì)胞PKC提取及活性測定。各處理因素作用后,吸棄培養(yǎng)液,細(xì)胞用預(yù)冷的HBSS洗3次,用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞,預(yù)冷的HBSS再洗2次,加入樣品緩沖液,超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞4次,每次5 s,63 000×g 4℃離心90 min,沉淀部分用含1.0%Triton-X-100的樣品緩沖液溶解,在4℃的搖床上搖動(dòng)30 min,勻質(zhì)液用樣品緩沖液稀釋到Triton-X-100的終濃度為0.5%,63 000×g離心15 min,上清液用作胞膜PKC激酶樣品。用ELISA法測定各組PKC活性,以Bio-Rad550型酶標(biāo)儀測定A490反映PKC活性大小。實(shí)驗(yàn)均設(shè)復(fù)孔,重復(fù)3次,取其均值。

1.6 熒光實(shí)時(shí)定量PCR

RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄按Trizol試劑說明書抽提不同組HPMC總RNA。按標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,所得cDNA進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)。Real-time PCR反應(yīng)總體系25 μ l,包括雙蒸水 9.5 μ l,cDNA 2 μ l,SYBR green realtime PCR master mix 12.5 μ l,上下游引物 各 0.5 μ l。FN 正鏈引物 5′AATATCTCGGTGCCATTTGC3′;負(fù)鏈引物 5′AAAGGCATGAAGCACTCAAT3′GAPDH 正鏈引物5′CAGGGCTGCTTTTAC3′;負(fù)鏈引物 5′GGGTGGAATCATATTGG3′。FN反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 30 s,隨后40循環(huán),包括95℃變性5 s,60℃退火并延伸30 s。每個(gè)基因設(shè)3復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用△△Ct=(Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)標(biāo))已處理-(Ct目的基因-Ct內(nèi)標(biāo))未處理,檢測樣品經(jīng)刺激后,其目的基因表達(dá)量相對于樣品原始狀態(tài)分別稱為已處理樣品和未處理樣品。首先使用內(nèi)標(biāo)基因GAPDH對模板進(jìn)行均一化處理,對于未處理樣品△△Ct=0,而20=1,所以未處理樣品的倍數(shù)變化為l,而對于已處理樣品相對于對照樣品的基因表達(dá)的倍數(shù)為 2-△△Ct,故2-△△Ct即為半定量指標(biāo)。

1.7 ELISA方法檢測細(xì)胞上清液中纖維連接蛋白的分泌

以1×105cells/well細(xì)胞密度接種24孔板,細(xì)胞80%～90%融合時(shí)換無血清培養(yǎng)基孵育24h使細(xì)胞同步化,加入上述各實(shí)驗(yàn)分組孵育細(xì)胞24 h,收集細(xì)胞上清液,以4℃,3000 r/min離心5min,棄細(xì)胞碎片,-80℃保存待測,同時(shí)對每孔細(xì)胞以胰蛋白酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。設(shè)6個(gè)復(fù)孔,ELISA檢測嚴(yán)格按照試劑盒操作,所得數(shù)據(jù)以細(xì)胞數(shù)進(jìn)行校正。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 AGE-HSA對人腹膜間皮細(xì)胞PKC活性的影響

2.1.1 AGE-HSA作用的時(shí)效關(guān)系 以AGE-HSA 500 μ g/ml作用 HPMC 0～ 120 min(圖 1),AGE-HSA作用15 min,即可使胞膜PKC活性升高。PKC活性在60 min達(dá)最高值,是刺激前的3.340倍。120 min時(shí)PKC活性還未完全降至刺激前水平,與對照組相比差異有顯著意義(P＜0.05)。

Fig.1 Time-dependent manners of AGE-HSA on PKC activitiesin HPMC

2.1.2 AGE-HSA作用的量效關(guān)系 HSA(500 μ g/ml)AGE-HSA(100 μ g/ml、500 μ g/ml、1 000 μ g/ml)作用60 min對胞膜PKC活性影響結(jié)果顯示:100 μ g/ml AGE-HSA對胞膜PKC活性無明顯影響,隨AGEHSA濃度增加PKC活性逐漸增強(qiáng)(P＜0.05,圖2)。

Fig.2 Dose-dependent manners of AGE-HSA on PKC activitiesin HPMC

2.2 AGE-HSA對人腹膜間皮細(xì)胞纖維連接蛋白mRNA的影響

AGE-HSA(0、100、500、1 000 ug/ml)作用HPMC 8 h的量效關(guān)系圖可知,隨著AGE-HSA刺激量的增加,HPMC的FN mRNA表達(dá)量也增加,呈量效關(guān)系;AGE-HSA 500 μ g/ml就 可以明 顯促進(jìn) FN mRNA 表達(dá),是空白對照組的(3.184±0.736)倍,1 000 μ g/ml AGE-HSA可使FN mRNA表達(dá)量進(jìn)一步增加為是空白對照組的(4.016±1.216)倍(P＜0.01,圖3)。500 μ g/ml AGE-HSA 作用(0、4、8、12 h)的時(shí)效關(guān)系圖顯示,HPMC的FN mRNA表達(dá)量在8 h達(dá)到最大值,并至少持續(xù)到12 h,為空白對照組的(2.014±0.567)倍(P＜0.01,圖4)。

Fig.3 Dose-dependent manners of AGE-HSA on FN mR NA expression of HPMC

Fig.4 Time-dependent manners of AGE-HSA on FN mR NA expression of HPMC

2.3 AGE-HSA對人腹膜間皮細(xì)胞合成和分泌纖維連接蛋白的影響

500 μ g/ml AGE-HSA刺激細(xì)胞 24 h后,FN合成和分泌明顯增加,為(128.8±8.6)ng/(ml·106cells)(P＜0.05),并呈現(xiàn)良好的劑量依賴效應(yīng),1 000 μ g/ml AGE-HSA可使FN的合成和分泌增加至(153.5±10.7)ng/(ml·106cells)(P＜0.01,圖 5)。

2.4 蛋白激酶C(PKC)參與AGE-HSA誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞合成和分泌纖維連接蛋白

500 μ g/ml AGE-HSA 和 80 nmol/L PMA 能夠促進(jìn)HPMC分泌細(xì)胞ECM 成份FN(P＜0.05),用PKC激動(dòng)劑佛波脂(PMA 100 nmol/L)孵育24 h耗竭細(xì)胞內(nèi)PKC后,AGE-HSA、PMA不能促進(jìn)HPMC分泌FN,PKC特異抑制劑calphostin C 100 nmol/L可以抑制AGE-HSA誘導(dǎo)的FN分泌。這說明PKC途徑參與了AGE-HSA促進(jìn)HPMC分泌FN(圖6)。

Fig.5 HSA and AGE-HSA on FN secretions of HPMC

Fig.6 Effects of PKC on the AGE-HSA-stimulated secretions of FN in HPMC HSA 500 μ g/ml,AGE-HSA 500 μ g/ml,PMA 100 nmol/L,Calphostin C 100 nmol/L

3 討論

腹膜透析,特別是持續(xù)性不臥床腹膜透析,是一種有效治療終末期腎臟疾病患者的方法。但近年來大量實(shí)驗(yàn)和臨床研究發(fā)現(xiàn),長期和反復(fù)使用以葡萄糖為基礎(chǔ)的腹透液進(jìn)行腹膜透析患者會(huì)出現(xiàn)腹膜纖維化,超濾失敗,最終放棄腹膜透析[4]。腹透相關(guān)性腹膜纖維化的主要組織學(xué)改變是腹膜間皮細(xì)胞層完整性破壞和間皮下基質(zhì)成分堆積兩方面。在基礎(chǔ)狀態(tài)下,人腹膜間皮細(xì)胞能夠合成和分泌各種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,如纖維連接蛋白、層粘連蛋白、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原等[5]。纖維連接蛋白(FN)是一種間質(zhì)型的基質(zhì)成分,其生成的增多提示間皮細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)分泌增加[6]。長期腹膜透析后,有大量的AGEs沉積腹膜上。在體內(nèi),腹膜上AGEs本身也可能刺激間皮細(xì)胞基質(zhì)的表達(dá),如腹膜基質(zhì)的主要組成成分層連蛋白的表達(dá)水平與AGEs的沉積呈明顯正相關(guān),AGEs誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞合成基質(zhì)增加,從而造成基質(zhì)蛋白大量堆積或基質(zhì)成分被AGEs修飾而發(fā)生結(jié)構(gòu)改變,導(dǎo)致腹膜硬化。而且沉積于腹膜的AGEs還可刺激單核巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1、TGF-β、PDGF等,從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成,導(dǎo)致腹膜纖維化[2]。我們在體外的研究發(fā)現(xiàn):AGE-HSA以時(shí)間、濃度依賴的方式促進(jìn)HPMC的細(xì)胞外基質(zhì)成份FN mRNA和蛋白的表達(dá)。

然而,AGEs促進(jìn)HPMC纖維連接蛋白合成增加的具體機(jī)制尚不清楚。Ha H等發(fā)現(xiàn),細(xì)胞內(nèi)PKC活化后,HPMC合成和分泌FN也隨之增加,因此作者認(rèn)為PKC途徑參與了HPMC合成和分泌FN的過程[7,8]。PKC是一個(gè)至少由12種絲氨酸/蘇氨酸激酶的同型異構(gòu)體組成的家族,它對細(xì)胞的許多過程(從基本的、自主的細(xì)胞功能到生物功能如記憶)都有調(diào)節(jié)作用。在未受激活的細(xì)胞中,PKC存在于細(xì)胞質(zhì)中活性很低,在與Ca2+、二酰基甘油等激動(dòng)劑結(jié)合后即發(fā)生酶構(gòu)象變化,PKC從胞漿移到胞膜或核內(nèi),從而被激活,因此本研究以胞膜的PKC作為酶活性的標(biāo)志。我們的研究發(fā)現(xiàn):隨AGE-HSA濃度增加,PKC活性呈劑量依賴關(guān)系,500 μ g/ml AGEHSA作用于HPMC可迅速激活PKC,活性高峰在60 min,先用PKC激動(dòng)劑PMA耗竭細(xì)胞內(nèi)PKC后、或者用PKC特異抑制劑calphostin C后,HPMC合成和分泌FN表達(dá)減少了。因此我們認(rèn)為,AGEs可能通過活化PKC,促進(jìn)HPMC合成和分泌FN。目前已經(jīng)證實(shí)活化的PKC可誘導(dǎo)原癌基因c-fos和c-jun的轉(zhuǎn)錄,而c-fos和c-jun通過AP-1鏈接位置基因轉(zhuǎn)錄,FN的啟動(dòng)區(qū)含有AP-1鏈接交感序列,故認(rèn)為活化的PKC誘導(dǎo)AP-1可能是AGE-HSA上調(diào)FN合成的一種機(jī)制[7]。Lee BH等人還發(fā)現(xiàn)PMA誘導(dǎo)分泌的FN的主要基因序列位于-69和+136[9]。PKC活化后不僅促進(jìn)FN的表達(dá),在腎小球系膜細(xì)胞還會(huì)增加Ⅳ型膠原的轉(zhuǎn)錄活性。AGEs除了可以通過PKC途徑合成FN外,在對大鼠系膜細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),AGE-BSA和CML-BSA通過活化TGF-beta-Smad信號通路促進(jìn)FN合成[10]。

總之,AGEs可能部分通過激活人腹膜間皮細(xì)胞中的PKC,促進(jìn)人腹膜間皮細(xì)胞合成和分泌FN,從而引起腹膜纖維化,最終導(dǎo)致腹膜失超濾。

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