宮 燕,陳 凱,喻蘇青,劉浩然,齊敏友△

(1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,杭州 310014;2.湖南大學(xué)化工學(xué)院,長沙 410082)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病并發(fā)癥中一類獨立的、特異性的心肌病變,早期通常表現(xiàn)為舒張期充盈受阻,晚期表現(xiàn)為收縮功能不全,易發(fā)生充血性心力衰竭等[1]。其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,近年來研究表明,氧化應(yīng)激與炎癥因子在糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展中占有重要的地位[2,3]。山茱萸為山茱萸科植物的干燥成熟果肉,其主要化學(xué)成分為多糖,環(huán)烯醚萜苷,萜類等,具有明顯的降血糖、抗氧化和保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等作用[4]。山茱萸總萜(terpenes from fructus corni,TFC)是其主要成分之一,前期研究發(fā)現(xiàn)山茱萸三萜烯酸(total triterpene acids,TTAs)可通過抑制ET-ROS通路保護(hù)糖尿病心肌病[5],但其是否可以通過抑制炎癥因子而抗糖尿病心肌病尚無報道。本實驗是以四氧嘧啶造成的糖尿病心肌病小鼠為模型,觀察山茱萸總萜對糖尿病小鼠心肌組織中炎癥因子和氧化應(yīng)激指標(biāo)的改變,為進(jìn)一步研究山茱萸總萜抗糖尿病心肌病的作用及機(jī)制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雄性昆明種小鼠,體重(20±2)g。由浙江省醫(yī)科院動物中心提供。合格證號:醫(yī)動字第20-003號。

1.1.2 藥物、試劑及儀器 山茱萸總萜,由湖南大學(xué)化工學(xué)院劉浩然博士提供,95%乙醇提取、大孔樹脂分離純化的方法來獲得萜類有效部位,以熊果酸為對照,經(jīng)HPLC分析,萜類提取物在70%以上;四氧嘧啶(sigma,上海貝基生物有限公司分裝批號:20080210);考馬斯亮蘭測試盒、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒,由南京建成生物工程有限公司提供;TNF-α、IL-6試劑盒,由武漢博士德生物工程有限公司提供。紫外分光光度計、離心沉淀機(jī)(鞏義市英峪予華儀器廠)、104型電子天平(Made by Mettler-Toledo Group)、WB22型恒溫水浴箱(Made in German)、強(qiáng)生穩(wěn)豪血糖儀和血糖試紙(美國強(qiáng)生公司提供)。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病心肌病小鼠模型的建立 健康雄性小鼠一次性腹腔注射四氧嘧啶220 mg/kg造成糖尿病模型。15 d后空腹12 h尾靜脈取血測血糖,將血糖高于13.9 mmol/L的小鼠隨機(jī)分為模型組和TFC組,另加正常小鼠作對照,每組10只。藥物以生理鹽水溶液混懸后灌胃(P.O,80 mg/kg),正常組和模型組以等體積生理鹽水灌胃,連續(xù)8周。

1.2.2 標(biāo)本處理 末次給藥24 h后,眼球取血,處死小鼠。取適量左心室組織稱重,在冰浴條件下加0.9%冷生理鹽水制成10%勻漿,離心(3 000 r/min,10 min),取上清液。-20℃保存,待用于生化指標(biāo)的檢測。

1.2.3 血清葡萄糖檢測 小鼠尾靜脈取血,用強(qiáng)生血糖儀測定各組血糖。

1.2.4 臟器系數(shù) 處死動物后,迅速取出心臟,剪除包膜、血管,用冰生理鹽水洗凈,濾紙吸干稱取全心重,剪去心房及右心室部分,濾紙吸干稱取左心室重,計算臟器系數(shù)(全心重量/體重;左心室重/全心重)。

1.2.5 心肌組織中氧化應(yīng)激、炎癥因子測定 取制備好的左心室組織勻漿液,嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測SOD活力和MDA含量;ELISA法測定腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)的水平 。

1.2.6 病理學(xué)檢測 取心肌組織,10%福爾馬林溶液固定,脫水,石蠟中浸泡、包埋,制成臘塊后制作切片,進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色,于光鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般體征

正常組小鼠毛色光亮、潔白,體態(tài)活潑,飲食與排便正常,體重逐漸增加。注射四氧嘧啶后,造模小鼠血糖升高,呈現(xiàn)明顯的多飲、多食、多尿癥狀,隨著時間延長,體重明顯減輕。TFC組小鼠相對模型組情況有所好轉(zhuǎn)(P＜0.01,表1)。

2.2 山茱萸總萜對小鼠血糖的影響

模型組小鼠血糖顯著升高,TFC組則使血糖含量相對模型組下降。結(jié)果表明:山茱萸總萜具有較好的降低血糖的作用(P＜0.01,表1)。

Tab.1 Changes of the body weight and blood glucose level(±s,n=10)

Tab.1 Changes of the body weight and blood glucose level(±s,n=10)

TFC:Terpenes from fructus corni**P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs model

Group Body weight(g) Blood glucose(mmol/L)Control 32.2±1.7 5.4±1.2 Model 18.1±1.9** 18.3±2.4**TFC 21.8±2.8## 13.8±2.2##

2.3 山茱萸總萜對心臟臟器系數(shù)的影響

8周后,糖尿病小鼠全心和左心室臟器系數(shù)較正常組升高(P＜0.01)。山茱萸總萜組對心臟器系數(shù)有明顯改善作用(P＜0.01,表2)。

Tab.2 Index of heart weight of mice(±s,n=10)

Tab.2 Index of heart weight of mice(±s,n=10)

TFC:Terpenes from fructus corni**P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs model

Group Heart weight/body weight(mg/g)Left ventricular/heart weight(mg/mg)Control 2.9±0.4 0.65±0.04 Model 3.6±0.2** 0.82±0.07**TFC 3.1±0.4## 0.70±0.09##

2.4 山茱萸總萜對心肌組織中炎癥因子TNF-α和IL-6的影響

模型組兩種炎癥因子濃度相對正常組均升高(P＜0.01),TFC組能明顯降低TNF-α和IL-6水平(P＜0.05)。表明山茱萸總萜可抑制心肌病變組織的炎癥因子,保護(hù)糖尿病心肌病變(表3)

Tab.3 Changes of TNF-α and IL-6 inmyocardium(±s,n=10)

Tab.3 Changes of TNF-α and IL-6 inmyocardium(±s,n=10)

TNF-α:Tumor necrosis factor-α;IL-6:Interleukin-6;TFC:Terpenes from fructus corni**P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs model

Group TNF-α(ng/ml) IL-6(pg/ml)Control 1.80±0.32 112.4±32.1 Model 2.31±0.45** 167.2±23.3**TFC 1.92±0.52# 132.5±38.6#

2.5 山茱萸總萜對心肌組織SOD活力和MDA含量的影響

模型組小鼠心肌SOD活力低于正常組(P＜0.01),MDA水平高于正常組(P＜0.01),提示機(jī)體抗氧化能力下降,心肌存在著過度的氧自由基。而TFC組能提高SOD活性(P＜0.01),降低MDA含量(P＜0.01),提示山茱萸總萜能明顯提高心肌的抗氧化能力,可能通過清除氧自由基來保護(hù)心肌組織(表4)

Tab.4 Changes of total MDA,SOD inmyocardium(±s,n=10)

Tab.4 Changes of total MDA,SOD inmyocardium(±s,n=10)

MDA:Malondialdehyde;SOD:Superoxide dismutase;TFC:Terpenes from fructus corni**P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs model

Group MDA(nmol/mg pro) SOD(U/mg pro)Control 5.1±0.6 109.5±11.6 Model 7.8±0.7** 75.7±12.4**TFC 6.4±0.4## 88.7±10.2##

2.6 山茱萸總萜對心肌組織結(jié)構(gòu)的影響

心肌組織進(jìn)行HE染色,在光鏡下觀察。結(jié)果表明:正常組小鼠心肌纖維成短柱狀,心肌細(xì)胞排列整齊致密,橫紋清晰,細(xì)胞間隙無增寬及狹窄,細(xì)胞核成橢圓形,位于中央,大小均一,可見少量成纖維細(xì)胞;模型組心肌細(xì)胞排列紊亂、腫脹而且肥大,肌纖維排列紊亂,局灶性壞死,細(xì)胞間隙增大、空泡樣變,心肌間質(zhì)有膠原纖維沉積,可見炎癥細(xì)胞和成纖維細(xì)胞浸潤;TFC組明顯得到改善,雖存在心肌纖維肥大、萎縮,但無明顯壞死,膠原纖維沉積較模型組有所減輕,心肌細(xì)胞基本排列整齊,部分病變區(qū)有心肌細(xì)胞肥大變性(圖1)。

Fig.1 Histopathology of myocardium tissue in each group(HE×100)

3 討論

本研究是以小鼠腹腔注射四氧嘧啶建立動物模型,四氧嘧啶在小鼠體內(nèi)可選擇性地被胰島β細(xì)胞吸收,產(chǎn)生超氧陰離子并直接破壞β細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu),損傷β細(xì)胞的DNA,導(dǎo)致胰島素原合成障礙,引起糖尿病[6],此方法基本符合糖尿病的臨床特點,已廣泛用于誘發(fā)實驗性糖尿病動物模型的制備。實驗中制備的糖尿病小鼠模型,空腹血糖顯著升高,說明模型建立初步成功,HE染色病理切片顯示,心肌細(xì)胞肥大、扭曲,細(xì)胞間隙增大,心肌間質(zhì)有膠原纖維沉積,進(jìn)一步說明本研究成功建立了糖尿病心肌病的模型。

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸(Cornusofficinalis Sieb.et Zucc.)的干燥成熟果肉,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,山茱萸具有抗炎殺菌、調(diào)節(jié)免疫、降血糖、抗氧化、強(qiáng)心等重要的藥用價值[7]。本文就主要以山茱萸總萜的降血糖、抗氧化、抗炎等三方面作用來進(jìn)行研究。血糖穩(wěn)定是保證器官組織生理功能正常的關(guān)鍵因素,研究表明[8],山茱萸含有的萜類成分是降糖作用的主要活性部位。另有研究顯示[9],山茱萸總萜可能是通過保護(hù)胰島β細(xì)胞或促進(jìn)受損β細(xì)胞的修復(fù)而提高血清胰島素水平,通過促進(jìn)糖原合成而增加肝糖原含量。本實驗結(jié)果表明:山茱萸總萜對糖尿病小鼠確實具有明顯的降血糖作用,而且在一定的范圍內(nèi),對器官組織細(xì)胞功能的修復(fù)和保護(hù)起到重要作用。氧化應(yīng)激在糖尿病心肌病病因?qū)W中起著重要的作用。本次實驗結(jié)果顯示:模型組的生成酶系脂質(zhì)過氧化物(MDA)過多,體內(nèi)清除活性氧的酶系超氧化物歧化酶(SOD)降低,說明四氧嘧啶致糖尿病心肌病小鼠的心肌氧化應(yīng)激狀態(tài)增強(qiáng),加重了心肌病變的損傷,而山茱萸總萜顯示了具有較好的抗氧化能力。炎癥因子具有全身性和心臟局部效應(yīng),與糖尿病一起協(xié)同誘導(dǎo)糖尿病心臟病發(fā)生,TNF-α和IL-6都是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分,參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)過程和能量代謝調(diào)節(jié)。過量的TNF-α、lL-6作為炎癥介質(zhì)可介導(dǎo)免疫損傷及一些嚴(yán)重的病理生理過程。本次研究表明模型組小鼠血清TNF-α、lL-6水平明顯高于正常組(P＜0.01),提示TNF-α和lL-6參與了糖尿病心肌病的發(fā)生和發(fā)展。同時,心肌病理組織切片顯示,模型組心肌細(xì)胞排列紊亂、腫脹而且肥大,細(xì)胞間隙增大,心肌間質(zhì)有膠原纖維沉積,可見炎癥細(xì)胞和成纖維細(xì)胞浸潤。山茱萸總萜組明顯得到改善,雖存在心肌纖維肥大、萎縮,但無明顯壞死,膠原纖維沉積較模型組有所減輕,心肌細(xì)胞基本排列整齊,進(jìn)一步表明山茱萸總萜對糖尿病心肌病的保護(hù)作用。

綜上所述,炎癥因子和氧化應(yīng)激參與了糖尿病心肌病的病理生理過程,山茱萸總萜對糖尿病引起的心肌病變具有良好保護(hù)作用,其機(jī)制可能與降血糖、抗氧化和炎癥因子有關(guān)。

[1]Galderisi M.Diastolic dysfunction and diabetic cardiomyopa-

thy:evaluation by Doppler echocardiography[J].J Am Coll Cardiol,2006,48(8):1548-1551.

[2]HamblinM,Friedman D B,Hill S,et al.Alterations in the diabetic myocardial proteome coupled with increased myocardial oxidative stress underlies diabetic cardiomyopathy[J].J Mol Cell Cardiol,2007,42(4):884-895.

[3]Westermann D,Rutschow S,Van Linthout S,et al.Inhibition of p38 mitogen-activated protein kinase attenuates left ventricular dysfunction by mediating pro-inflammatory cardiac cytokine levels in a mouse model of diabetes mellitus[J].Diabetol,2006,49(10):2507-2513.

[4]于 淼,王曉先.山茱萸的藥理作用研究進(jìn)展[J].東南國防醫(yī)藥,2010,12(3):240-243.

[5]Qi M Y,Liu H R,Dai D Z,et al.Total triterpene acids,active ingredients from Fructus Corni,attenuate diabetic cardiomyopathy by normalizing ET pathway and expression of FKBP 12.6 and SERCA2a in streptozotocin-rats[J].J Pharm Pharmacol,2008,60(12):1687-1694.

[6]巫光宏,伍志權(quán),何典路,等.虎奶菇菌核多糖對四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠的降血糖作用[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2007,28(4):100-104.

[7]李雅梅,李 華,李春榮.山茱萸化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J].武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2010,19(6):500-502.

[8]高大成,范玉生.山茱萸活性成分的鑒定及降糖效果的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2008,20(12):92-94.

[9]韓璟超,季 暉,薛成鋒,等.山茱萸總萜的降血糖作用[J].中國天然藥物,2006,4(2):125-129.