朱小麗，陳少鶯，林鋒強(qiáng)，程曉霞，陳仕龍，黃梅清，王 劭，李兆龍

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福建福州 350013）

番鴨小鵝瘟病是1997年以來在福建省莆田、福清等番鴨飼養(yǎng)區(qū)出現(xiàn)的番鴨疫病，其病原為鵝細(xì)小病毒（Goose parvovirus，GPV），臨床主要表現(xiàn)為不同程度腹瀉、部分病番鴨腸粘膜脫落形成栓塞，發(fā)病率50%～70%、病死率40%～65%，給養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。而且該病與番鴨細(xì)小病毒病在流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化相似，兩者在血清學(xué)上有交叉反應(yīng)，臨床上難于鑒別診斷，常被基層獸醫(yī)誤診為番鴨細(xì)小病毒病[4-7]。因此建立鑒別診斷番鴨小鵝瘟病的快速診斷試劑至關(guān)重要。膠乳凝集方法（LPA）具有操作簡(jiǎn)便、快速和判定直觀等優(yōu)點(diǎn)，適于基層獸醫(yī)防疫部門及專業(yè)戶用做臨床診斷、流行性病學(xué)調(diào)查。本研究根據(jù)程由銓等制備GPV膠乳的方法[4]，應(yīng)用抗番鴨源GPV單克隆抗體（GPV-MAb-D11）致敏聚苯乙烯膠乳，研制出GPV乳膠試劑，建立了LPA的檢測(cè)方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株與抗體 番鴨源GPV-PT（對(duì)番鴨胚成纖維細(xì)胞TCID50為10-5.0/0.1 ML）、番鴨呼腸孤病毒（MDRV）、新型鴨呼腸孤病毒（MDRV）、番鴨細(xì)小病毒（MPV）、鴨源副黏病毒（PMV）和鴨肝炎病毒（DHV）及其相應(yīng)血清均由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存；抗番鴨源GPV MAb（GPV-M cAb-D11）由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 主要試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 10%聚苯乙烯膠乳購(gòu)自Sigma公司；牛血清白蛋白（BSA）和甘氨酸（GBS）購(gòu)自廈門泰京生物技術(shù)有限公司；基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；PCR試劑購(gòu)自Fermentas公司；健康番鴨購(gòu)自莆田廣東溫氏家禽有限公司。

1.3 抗原制備 將12日齡發(fā)育正常的番鴨胚尿囊腔接種GPV-PT種毒0.1 ML/胚，37℃培養(yǎng)，每日觀察2次，收獲接種后48 h～120 h死亡胚胚液，3 000 r/min離心10 Min，取上清液加入甲醛至終濃度為0.1%，37℃滅活24 h后即為GPV抗原，4℃～8℃保存。同理制備 MDRV、MPV、PMV和DHV抗原。

1.4 抗體濃度的測(cè)定 按考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定抗體蛋白質(zhì)濃度，分裝，-20℃以下保存。

1.5 膠乳致敏 將10%聚苯乙烯膠乳用pH8.2 GBS緩沖液稀釋至1%，6 000 r/min離心5min，棄上清液，沉淀用GBS重懸至原體積，加入等體積GPV-MAb-D11，混和后，37℃水浴感作40 Min，以含1%BSA的GBS洗2次，6 000 r/min離心5min，沉淀重懸于0.1%BSA-GBS，乳膠終濃度為1%，按總量加入疊氮鈉至終濃度為0.025%，共制備5批膠乳試劑（批號(hào)為0901～0905）。

1.6 LPA試驗(yàn) 將10μL待檢樣品與等量致敏膠乳在潔凈玻片上混勻，37℃水浴15min，觀察凝集反應(yīng)，同時(shí)設(shè)致敏膠乳對(duì)照、GPV陽(yáng)性對(duì)照和PBS陰性對(duì)照。結(jié)果判定：++++：1 Min～3 min內(nèi)出現(xiàn)粗大凝集塊，液體澄清；+++：形成較大的凝集塊，并且液體澄清；++：50%膠乳凝集，顆粒明顯，液體較澄清；+:少量膠乳凝集，液體較渾濁；陰性：無顆粒凝集，液體呈均勻乳狀。以出現(xiàn)“+”以上凝集判為陽(yáng)性；以出現(xiàn)“+”凝集的抗原最高稀釋度的倒數(shù)為抗原凝集價(jià)。

1.7 LPA特異性測(cè)定 將2批膠乳試劑分別與GPV、MPV、MDRV、NDRV、PMV、DHV和正常培養(yǎng)液、組織懸液進(jìn)行LPA試驗(yàn)，評(píng)價(jià)其特異性。

1.8 LPA敏感性測(cè)定 將2批膠乳試劑分別與不同濃度的GPV抗原進(jìn)行LPA試驗(yàn)，測(cè)定其LPA檢測(cè)最小蛋白量，評(píng)價(jià)其敏感性。

1.9 LPA重復(fù)性 3批膠乳試劑與GPV抗原分別進(jìn)行3次效價(jià)測(cè)定，評(píng)價(jià)其批內(nèi)和批間重復(fù)性。

1.10 LPA試劑保存期測(cè)定 將5批乳膠試劑置于4℃保存，每隔1個(gè)月與特異性抗原進(jìn)行LPA試驗(yàn)，測(cè)定其保存期。

1.11 LPA與PCR符合率的比較 2日齡健康番鴨經(jīng)腿肌人工感染GPV-PT 0.2m L/羽，同時(shí)設(shè)健康對(duì)照隔離飼養(yǎng)，于感染后3 d、5 d、7 d各迫殺3羽，取肝、脾、胰、腎組織制作勻漿，進(jìn)行GPV抗原檢測(cè)：（1）LPA檢測(cè)：勻漿中加入等體積氯仿振蕩3m in～5 min，以6 000 r/m in離心15 Min，取水相進(jìn)行LPA檢測(cè)；（2）PCR檢測(cè)：取勻漿提取DNA，按照參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行PCR檢測(cè)，比較LPA和PCR的符合率。

1.12 臨床疑似病例檢測(cè) 收集臨床疑似番鴨小鵝瘟病例18例，取肝、脾、胰、腎組織制作勻漿進(jìn)行LPA和PCR檢測(cè)，比較LPA和PCR的符合率。

2 結(jié)果

2.1 MAb致敏濃度的篩選 MAb致敏膠乳的蛋白濃度為0.5 mg/mL時(shí)，LPA試驗(yàn)?zāi)w粒較大，液體較澄清，凝集反應(yīng)時(shí)間20 Min，抗原凝集價(jià)最高為25；蛋白濃度為0.2 g/mL時(shí)，LPA試驗(yàn)?zāi)w粒大而清晰，液體清亮，凝集反應(yīng)時(shí)間15 min，抗原凝集價(jià)最高為25；蛋白濃度為0.1 mg/mL時(shí)，LPA試驗(yàn)?zāi)w粒較小，液體混濁，凝集反應(yīng)時(shí)間為35m in；抗原凝集價(jià)最高為23；蛋白濃度為0.05mg/mL時(shí)LPA試驗(yàn)無凝集。結(jié)果表明MAb最佳致敏濃度為0.2mg/mL。

2.2 LPA特異性試驗(yàn) 0901批和0902批膠乳試劑只與GPV反應(yīng)產(chǎn)生特異性凝集反應(yīng)，凝集顆粒大而清晰，液體清亮不與 MPV、MDRV、NDRV、PMV、DHV和正常培養(yǎng)液、正常組織懸液發(fā)生特異性凝集反應(yīng)，表明膠乳試劑特異性好。

2.3 LPA敏感性 0901批和0902批膠乳試劑分別與不同毒價(jià)的GPV抗原進(jìn)行LPA試驗(yàn)，當(dāng)GPV毒價(jià)為 104、5 000、2 500、1 500、1 000 TCID50時(shí)均可以產(chǎn)生特異性凝集顆粒，而當(dāng)GPV毒價(jià)為500、100 TCID50時(shí)，LPA檢測(cè)為陰性。結(jié)果表明LPA可以檢出GPV毒價(jià)最低為1 000 TCID50，膠乳試劑敏感性高（表 1）。

表1 LPA方法的敏感性Table 1 Sensitivity of the LPA method

2.4 LPA重復(fù)性試驗(yàn) 將0901、0902和0903批膠乳試劑與GPV胚液和病鴨肝脾組織懸液分別進(jìn)行3次效價(jià)測(cè)定，結(jié)果均分別為26和22。表明膠乳試劑批內(nèi)和批間重復(fù)性良好。

2.5 LPA保存期試驗(yàn) 5批次乳膠試劑在4℃保存11個(gè)月效價(jià)不變，均可以達(dá)到26，12個(gè)月時(shí)效價(jià)開始下降，14個(gè)月時(shí)降為21，表明膠乳試劑4℃保存11個(gè)月內(nèi)質(zhì)量穩(wěn)定（表2）。

表2 乳膠試劑的保存期測(cè)定Table 2 Determ ination of the Latex reagent storage period

2.6 LPA方法檢測(cè)人工感染番鴨 人工感染GPV-PT株番鴨肝、脾組織勻漿經(jīng)氯仿抽提后，能與乳膠試劑產(chǎn)生肉眼可見的特異性凝集顆粒，而對(duì)照組健康番鴨肝、脾組織勻漿均無凝集反應(yīng)，與PCR比較，總符合率達(dá)93.3%（表3）。同時(shí)，番鴨人工感染后3 d即可以在組織勻漿中檢出GPV抗原，而此時(shí)感染鴨尚未表現(xiàn)出臨床癥狀，因此應(yīng)用乳膠試劑建立的LPA方法可以為該病的早期診斷提供一種新手段。

2.7 臨床疑似病例檢測(cè) 采用LPA檢測(cè)臨床樣品18例，其中GPV陽(yáng)性11份，GPV陰性7份；PCR檢測(cè)18例，其中GPV陽(yáng)性12份，陰性6份；兩種方法檢測(cè)結(jié)果僅有1份樣品不一致，符合率為94.5%（17/18）（表4）。因此LPA方法可為臨床疑似病例的快速診斷。

表3 應(yīng)用LPA和PCR檢測(cè)臨床疑似GPV病例Table 3 The application of LPA and PCR detect infected artificially the GPV antigen of Muscovy ducks in the organization

表4 應(yīng)用LPA和PCR檢測(cè)臨床可疑GPV病例Table 4 The application of LPA and PCR detect clinically samples

3 討論

至今國(guó)內(nèi)外對(duì)小鵝瘟病的診斷進(jìn)行了較多研究及報(bào)道，如病毒分離鑒定、免疫熒光、ELISA、AGP、PCR等均可以用于檢測(cè)GPV抗原。其中，病毒分離鑒定和中和試驗(yàn)是確診GPV的經(jīng)典方法，但操作煩瑣、費(fèi)時(shí)（7 d以上），而且分離培養(yǎng)后的病毒還需結(jié)合其他診斷方法才可以判斷為GPV感染；雙夾心ELISA法只能用于檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物中的GPV抗原，操作煩瑣，不適用于臨床快速診斷[8]；小鵝瘟免疫熒光檢測(cè)方法具有檢出率高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便、快速（一般只需2 h）等特點(diǎn)，但需配備熒光顯微鏡[9]。近年發(fā)展的PCR、核酸探針等技術(shù)雖具有較高的特性和敏感性，但對(duì)使用者的操作技能要求較高，技術(shù)性強(qiáng)、操作繁雜而且費(fèi)用較高等。而乳膠凝集試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便、快速、特異、結(jié)果判定直觀方便（不需特殊儀器，僅憑肉眼觀察即可）、質(zhì)量穩(wěn)定，特別適于基層和臨床快速診斷、流行病學(xué)調(diào)查[7,10]。本研究應(yīng)用抗番鴨源小鵝瘟MAb標(biāo)記聚苯乙烯乳膠，研制成小鵝瘟病乳膠診斷試劑，并建立了檢測(cè)GPV抗原的LPA試驗(yàn)。在LPA檢測(cè)中，該試劑僅與GPV呈凝集反應(yīng)，而與MPV不反應(yīng)，表現(xiàn)良好的特異性；LPA與PCR符合率達(dá)90%以上，表現(xiàn)良好的準(zhǔn)確性。而且操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間小于60min。該方法目前國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道。

臨床上番鴨可以感染小鵝瘟病和番鴨細(xì)小病毒病，而且存在兩者的混合感染；GPV與MPV不僅在病毒大小形態(tài)、結(jié)構(gòu)蛋白、理化特性和核酸類型等方面極為相似[11-12]，而且在血清學(xué)方面存在明顯交叉反應(yīng)[4]，僅根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化難于診斷。因此，應(yīng)用高免血清建立的免疫學(xué)檢測(cè)方法難以區(qū)分發(fā)病番鴨群中GPV和MPV的感染問題。本研究應(yīng)用抗GPV特異性MAb標(biāo)記聚苯乙烯乳膠并建立的LPA方法則能夠鑒別MPV和GPV感染，解決了臨床診斷上的難題。

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